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技术文章

关于夹心法ELISA检测白介素8的一些实验方法

点击次数:3568 发布时间:2015/3/7 17:08:52

 Il-8是一种分子量为8~10kD的多肽,对嗜中性粒细胞,T淋巴细胞、嗜硷性粒细胞具有趋化作用,并可激活嗜中性粒细胞,是一种重要的炎症介质。在严重感染病人的血清中、炎症局部渗出液中都可检测到高水平的IL-8。此外,近年来的研究表明,IL-8可能与各种组织缺血后再灌注损伤的发生有关。我们采用两株自制的单克隆抗体建立了夹心法ELISA用于检测IL-8,敏感性可达156Pg/ml,操作简单,重复性良好,可用于IL-8的基础和临床研究。

一、原理:采用两株识别不同表位的抗IL-8单克隆抗体,其中一株(4D7)作为包被抗体,以识别和结合待检标本中的IL-8,另一株作为酶标抗体,与结合于包被抗体的IL-8的另一个表位结合并催化底物显色。

二、试剂器材

1. 试剂盒提供包被抗体、酶标抗体、标准品,底物(ABTS)、96孔elisa板。

2. 包被缓冲液、PBS、底物缓冲液配制同常规ELISA法。

三、操作步骤:

1. 包被:pH9.5 碳酸盐缓液稀释4D7单克隆抗体粗提γ球蛋白至1μg/ml,加入96孔板,100μl/孔,放4℃,36小时。

2. 封闭:0.1%吐温PBS(Buffer A)冲洗96孔板三次,加3%BSA Buffer A(Buffer B)200μl/孔,放37℃,1小时。

3. 加待检样品:Buffer A 冲洗96孔板三次,加待检样品及Buffer B 稀释的标准品100μl/孔,放37℃,3小时。

4. 加酶标抗体:Buffer A冲洗96孔板五次,3%PEG Buffer A稀释酶标抗体至1∶800,加入96孔板,100μl/孔,放37℃,1小时。

5. 显色:Buffer A冲洗96孔板五次,pH5.4柠檬酸缓冲液溶解底物(ABTS),0.2mg/ml,加3%H2O2,2μl/ml,加入96孔板,100μ/孔,室温下或37℃显色。

四、注意事项:

1. 待检标本如为血清,应采用一次性容器,血液采集后尽快(6小时以内)分离血清。

2. 封闭液或抗体稀释液应新鲜配制或冻存。

原创作者:上海心语生物科技有限公司

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