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人白细胞介素6（IL-6）定量检测试剂盒（ELISA）说明书
【产品名称】
通用名称：人白细胞介素6（IL-6）定量检测试剂盒（ELISA）
英文名称：Human Interleukin-6（IL-6）ELISA KIT
【参数规格】
48人份/盒，96人份/盒
【预期用途】
仅供科研使用，定量检测血清、血浆、细胞培养上清液中人白细胞介素6（IL-6）的浓度。
【检验原理】
人白细胞介素6（IL-6）定量检测试剂盒（ELISA）采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）。在预包被抗人白细胞介素6（IL-6）抗体（固相抗体）的微孔酶标板中，加入人白细胞介素6（IL-6）校准品和待测样本，再加入另一株HRP标记的抗人白细胞介素6（IL-6）抗体（酶标抗体），经过温育与充分洗涤，去除未结合的组分，在微孔板固相表面形成固相抗体-抗原-酶标抗体的夹心复合物。加底物A和B，底物在HRP催化下，产生蓝色产物，在终止液（2M 硫酸）作用下，*终转化为黄色，在酶标仪上测定吸光度（OD值），吸光度（OD值）与待测样品中人白细胞介素6（IL-6）的浓度正相关。拟合校准品曲线，可以计算出样本中人白细胞介素6（IL-6）的浓度。
【主要组成成分】
主要成分
|
组分 |
数量 |
主要成分 |
| 校准品 | 0.5ml/管*6管 | 抗原配制的6个浓度标准品 |
| 包被微孔板 | 96T | 预包被固相抗体 |
| HRP标记抗体 | 6mL | HRP标记的检测抗体 |
| 底物液A | 6mL | 过氧化脲工作液 |
| 底物液B | 6mL | TMB工作液 |
| 20×浓缩洗涤液 | 30mL | 含0.15%Tween20的PBS |
| 说明书 | 1份 | －－ |
| 自封袋 | 1个 | －－ |
| 不干胶 | 2片 | －－ |
校准品浓度依次为：320、160、80、40、20、0 pg/ml。校准品已经通过测试，结果表明HBs抗原阴性，HIV1、HIV2和HCV抗体阴性，由于不存在一种试验方法能够完全保证没有这些物质，本品必须按照具有潜在的感染性进行处理，处理过程应当遵循通用的安全措施。
需要但未提供的材料及耗材
1、酶标仪
2、精密移液器及一次性吸头
3、蒸馏水
4、洗瓶或者自动洗板机
5、37℃水浴锅或恒温箱
6、500ml量筒
7、无粉一次性乳胶手套
8、质控品（可从蓝图生物科技产品研发系统中选择）
【储存条件及有效期】
1、2-8℃保存，切勿冷冻，有效期6个月。
2、开封使用后，包被微孔板放入带有干燥剂的自封袋中，密闭自封袋，并将全部试剂放回2-8℃冰箱。
3、开封后，按照建议的条件保存，校准品、包被微孔板和HRP标记抗体，有效期为14天，其他成分在标签标明的有效期内是稳定的。
【适用仪器】
半自动的酶标仪，如Thermo MK3，或者国产酶标仪。
【样本要求】
样本类型和采集
以下只是列出样品采集的一般指南。所有样本采集过程中，不得使用叠氮钠做为防腐剂。
1、细胞培养上清：4000rpm条件下离心20min，去除细胞颗粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反复冻融。
2、血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，4000rpm条件下离心20min，小心地分离出血清，保存在- 20℃以下，避免反复冻融。
3、血浆：肝素，EDTA，或柠檬酸钠作为抗凝剂。在4000rpm条件下，离心20分钟取上清，血浆保存在-20℃以下，避免反复冻融。
样本保存和稳定性
样本在2-8℃条件下，可以储存72h，或者在- 20℃储存6个月。样本收集后，不是一次检测完，请按一次用量分装冻存，避免反复冻融，使用时在室温下解冻，确保样品均匀充分解冻。
【检验方法】
试剂准备
1、使用前，所有的组分都要至少复温30min，确保充分复温到室温。
2、浓缩洗涤液：从冰箱取出的浓缩洗涤液，会有结晶产生，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解。浓缩洗涤液与蒸馏水，按1:20稀释，即1份的浓缩洗涤液，添加19份的蒸馏水。
3、底物：底物液A和B，在使用前，按1:1体积充分混合，混合后15分钟内使用。
操作程序
1、所有试剂和组分都先恢复到室温，标准品、质控品和样品，建议做复孔。
2、按前面试剂准备中描述的方法，配制好试剂盒各种组分的工作液。
3、从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。
4、设置标准品孔、样本孔和空白孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL，样本孔加待测样本50μL，空白孔不加。
5、除空白孔外，标准品孔和样本孔，加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μL。
6、用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
7、揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置20s，甩去洗涤液，吸水纸上拍干。
8、如此重复4次（共洗板5次）。若使用自动洗板机，请按洗板机操作程序进行洗板，添加浸泡20s的程序，可以提高检测的精度。洗板结束，加底物前，要在干净不掉屑的纸上，充分拍干反应板。
9、将底物A和B按1:1体积充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱温育15min。
10、所有孔加入终止液50μL，在酶标仪上读取各孔吸光度（OD值）。
【检验结果的解释】
检测完成后，以标准品浓度做为纵坐标，对应的吸光度（OD值）作为横坐标，利用计算机软件，采用四参数Logistic曲线拟合（4-pl），创建标准曲线方程，通过样本的吸光度（OD值），利用方程计算样品的浓度值。
如果样品被稀释，通过上述方法测的的浓度值，要乘以稀释倍数，才是样品的*终浓度。
【检验方法的局限性】
1、仅供科研使用，不得用于临床诊断。
2、在试剂盒标示的有效期内使用，过期产品不得使用。
3、跟其他厂家的试剂盒或者组分不能混用。
4、使用试剂盒配套的样品稀释液。
5、如果样本值高于标准品浓度值，请将样本适当稀释后，再重新测定。
6、待测样本中存在的人抗鼠等异嗜抗体会干扰检测结果，检测前，请排除该因素。
7、通过其他方法得到的检测结果，与本试剂盒测定结果不具有直接的可比性。
【产品性能指标】
1、物理性能
试剂盒的各液体组分应澄清透明、无沉淀或者絮状物。微孔板铝箔袋应真空包装，无破损漏气。
2、剂量反应曲线线性
校准品剂量反应曲线相关系数r值，大于等于0.9900。
3、精密度
批内精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在同一个板块内精度评估。批内变异系数CV%小于10%。
批间精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在不同板块内精度评估。批间变异系数CV%小于15%。
4、灵敏度
检出剂量小于0.7pg/mL。
5、回收率
三组已知的高、中、低浓度样品，进行五次回收率评估，回收率在85%-115%之间。
6、特异性
本试剂盒识别天然和重组人白细胞介素6（IL-6），与结构类似物无交叉。
7、稳定性
2℃-8℃保存，有效期6个月。
【注意事项】
生物安全
1、检测必须符合实验室管理规范的规定，严格防止交叉污染，所有样品、洗弃液和各种废弃物都应按照传染物进行处置。
2、试剂盒的液体组分中，含有proclin-300防腐剂，可能引起皮肤过敏反应，避免吸入烟雾与皮肤接触。
3、底物液对皮肤、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入烟雾。戴上防护手套，实验完成后彻底洗手。
技术提示
1、混合蛋白溶液时，避免起泡。
2、加校准品与样本时，每个校准品浓度和样本都要更换移液枪头，公共组分应该悬臂加样，避免交叉污染。
3、合适的温育时间，和充分的洗涤步骤，是保证实验结果准确性的必要条件。
4、底物溶液为无色液体，保存过程中变为蓝色，代表底物溶液已经失效，不得使用。
5、终止液加样顺序与底物溶液加样顺序一致，加入终止液后，蓝色底物产物，会瞬间变为黄色。
6、实验中，用剩的板条，应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
7、所有液体组分，使用前充分摇匀，严格按照说明书标明的时间、加样量及加样顺序进行温育操作。
废物处理
所有使用或未使用的试剂，所有污染性的一次性材料，应当遵循传染性或潜在传染性产品的处理程序，每个实验室都有责任根据其实验的类型和危险性级别，进行废物和污物的处理，同时要严格依照有关规定对待所有的废物和污物。
【公司介绍】
企业名称：泉州市蓝图生物科技有限公司
生产地址：福建省泉州市泉港区界山镇蓝图生物科技园A栋501室
【说明书批准日期及修改日期】
批准日期：2013.05.12
次修改日期：2016.02.16
