实验原理：

  本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫法（ELISA）测定标本中辣椒烟草花叶病毒（TMV）水平。用纯化的辣椒烟草花叶病毒（TMV）抗体包被微孔板，制成固相抗体，可与样品中辣椒烟草花叶病毒（TMV）相结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后再与HRP标记的辣椒烟草花叶病毒（TMV）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成*终的黄色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），与CUTOFF值相比较，从而判定标本中辣椒烟草花叶病毒（TMV）的存在与否。

试剂盒组成：

样本处理及要求：

1. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.

2. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤：

1. 编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照2孔、阳性对照2孔、空白对照1孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）

2. 加样：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照50μl。然后在待测样品孔先加样品稀释液50μl，然后再加待测样品10μl。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，

3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。   

4. 配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液加蒸馏水至600ml后备用

5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 

7. 温育：操作同3。

8. 洗涤：操作同5。

9. 显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟

10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

结果判定：

  试验有效性：阳性对照孔平均值≥1.00; 阴性对照平均值≤0.10

  临界值（CUT OFF）计算：临界值=阴性对照孔平均值+0.15

  阴性判定：样品OD值< 临界值（CUT OFF）者为辣椒烟草花叶病毒（TMV）阴性

  阳性判定：样品OD值≥ 临界值（CUT OFF）者为辣椒烟草花叶病毒（TMV）阳性

注意事项

1．操作严格按照说明书进行，本试剂不同批号组分不得混用。

2．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

3．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

4． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

5．底物请避光保存。

6．试验结果判定必须以酶标仪读数为准，使用双波长检测时，参考波长为630nm

7．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。终止液为2M的硫酸，使用时必须注意安全。

保存条件及有效期

1．试剂盒保存：2-8℃。

2．有效期：6个月

原创作者：北京绿源大德生物科技有限公司