资料简介：  RNA PowerSoil® Total RNA Isolation kit

强力土壤® 总RNA 提取试剂盒

操作步骤更新：

l （步骤3‐5）酚lv仿（pH6.5‐8.0，[用户自备]）从原来5min 涡旋震荡后加入，改为涡旋振荡前加入。

l （步骤12）步骤12 的孵育改为在室温下进行。若原来‐20℃温度下孵育能获得理想得率，你可维持原温度孵育。

简介

RNA PowerSoil® Total RNA Isolation Kit 专门设计用于提取土壤微生物总RNA。试剂盒性能优越，能始终如一地去除腐植酸、富哩酸等RT‐PCR 抑制因子获得纯净的，可直接用于RT‐PCR 分析的高质量纯净RNA。通过RT‐PCR扩增RNA，证明包括堆肥、底泥、粪肥等富含有机物的各种类型土壤，使用此试剂盒均能体现微生物结构完整性。使用LifeGuard™ Soil Preservation Solution 能在采集用于RNA 提取的土样后，运输保存过程中，保持细菌存活的同时使其与处休眠状态。无论从什么地方采集土样，抑制RNase 和DNase 的活性可保证cDNA 的全长合成，以及16s rRNA profiling。LifeGuard™可保持微生物群落结构，‐20℃ 30 天，4℃ 2 星期，室温 1 星期。室温下保持RNA 完整性30 天。我们不建议用RNALater 或RNAProtect 保护土壤核酸。

操作预览

土壤微生物多样性的动态性根据微生物群落族群及其新陈代谢状态变化而变化。影响因素有土壤的成分、含水量、日光照射、可利用养分等环境条件。RNA PowerSoil® Total RNA Isolation kit 设计可提取土壤微生物及微动物总RNA，包括休眠、正常代谢及死亡的微生物。RNA PowerSoil® Total RNA Isolation kit 可以提供完整的土壤微生物群落结构图及RNA 成分表。

此试剂盒仅供研究用途，非诊断用。

相关产品                              货号            数量

RNA PowerSoil® DNA Elution Accessory Kit   12867‐25        25 preps

LifeGuard™ Soil Preservation Solution      12868‐100        100ml

12868‐1000        1000ml

UltraClean Agarose, Molecular Biology Grade  15003‐50        50g

15003‐100       100g

15003‐500       500g

15003‐1000      1kg

UltraClean®PCR Clean‐Up Kit               12500‐50       50 preps

12500‐100      100 preps

12500‐250      250 preps

新产品！试用我们的LifeGuard™ Soil Preservation Solution(MO BIO 货号：12868‐100)

室温下运输或保存土样样品期间保护核酸稳定长达30 天！

重要提醒：此试剂盒需要用户自备酚/lv仿/异戊醇溶液（25:24:1， pH6.5‐8.0）可从Amresc，Incorporated 或VWRInternational 公司购买（见“酚/lv仿/异戊醇供应商”名单），或用户自制。

注意：苯酚及酚/lv仿/异戊醇容易被氧化呈现黄色或粉红色，指示该溶液不再适合用于RNA 提取。使用带颜色的酚/lv仿/异戊醇可能会影响*终RNA 的质量。使用前存放于干净的容器中，旋紧盖子并避光4℃保存，以延长保质期。

设备要求：

15ml 管离心机（2500g）

微型离心机（13000g）

移液器（20μl~1000μl）

移液器（1ml & 10ml）

水浴加热设备（45℃，可选）

Vortex‐Genie®2 涡旋仪（MO BIO 货号#13111‐V‐220）

涡旋仪适配器（MO BIO 货号#13000‐V1‐15）

需要但不提供的试剂

苯酚：lv仿：异戊醇溶液

试剂盒组分

货号：12866‐25

组分 量

Bead Tubes (with 1.5g beads) 25

Bead Solution 69ml

Solution SR1 7ml

Solution SR2 22ml

Solution SR3 42ml

Solution SR4 165ml

Solution SR5 110ml

Solution SR6 28ml

Solution SR7 3ml

RNA Capture Columns 25

15ml Collection Tubes 100

2.2ml Collection Tubes 25

△实验前请先逐一检查试剂!

购买现成酚lv仿溶液

厂家名称 试剂名称 货号 体积（ml）

Amresco,

Incorporated

Phenol: Chloroform (pH 6.7/8.0) 25:24:1

premixed with isoamyl alcohol

0883‐100 100

Amresco,

Incorporated

Phenol: Chloroform (pH 6.7/8.0) 25:24:1

premixed with isoamyl alcohol

0883‐400 400

VWR International

Phenol: Chloroform premixed with

Isoamyl Alcohol 25:24:1

100513‐510 100

VWR International

Phenol: Chloroform Buffered Solution

25:24:1    IB05174    400

保存

组分室温（15‐30℃）保存。

操作步骤：

1、加入2g 土壤样品到一个Bead Tubes（试剂盒提供）中。注意：参考疑难点关于土样加样量问题。

2、加入2.5ml Bead Solution、0.25ml SR1 溶液、0.8ml SR2 溶液到Bead Tubes，涡旋混匀。

这一步发生了什么：缓冲液Bead Solution 可分离微生物细胞与土壤成分。SR1 溶液含有SDS 以及其它用于细胞裂解的试剂。SDS 作为去垢剂，能破坏细胞膜上的脂肪酸、脂质。SR2 溶液为沉淀溶液，可去除腐殖质、细胞碎片及蛋白质等非DNA 的有机、无机成分。有机及无机成分的污染会影响到*终RNA 的质量并抑制下游RNA 实验。涡旋振荡是样品均质化和细胞裂解的关键步骤。

注意：温度过低时会产生沉淀。60℃水浴可重溶SDS，并可趁热使用。

3、加入3.5ml 酚/lv仿/异戊醇溶液（pH6.5‐8.0，[用户自备]），涡旋混匀直至分离层消失。

这一步发生了什么：加入酚lv仿可获得zui佳裂解效率和得率。裂解的细胞组分留在了有机相，蛋白变性。

4、把Bead Tubes 固定在涡旋仪适配器（货号13000‐V1‐15）上，转速（3200rpm）涡旋连续振荡15min。这一步发生了什么：微生物细胞在1‐3 步化学（裂解缓冲液）和机械（涡旋振荡）力共同作用下崩解。使用MO BIO 的适配器是均质化样品、裂解细胞的*经济方法。你也可以用胶带把Tube 管固定在涡旋仪3.5 英寸橡胶平板上。不过需要注意的是，胶带会在涡旋振荡过程中会松脱，造成裂解效率下降，样品间结果不统一或得率不高。

5、取下Bead Tube，室温下2500g 离心10min。

这一步发生了什么：离心使得相位分离，*终可见三个分离层。*下层含有蛋白、细胞碎片，中间层含有腐殖质及其他有机无机成分，*上层含有总核酸。注意：中间层的厚薄决定于样品类型，富含有机质的样品会形成更厚的中间层。

6、小心地把Bead Tube 从离心机取下，转移上分离层（避开中间层及底部分离层）到一个干净的15ml 收集管中（试剂盒提供）。中间层的厚薄视样品类型而定。Bead Tube 中余下的酚/lv仿/异戊醇溶液弃于专用废液回收容器中。注意：富含无机物的土壤，中下分离层可能比较厚实，需要用枪头刺入底部苯酚层。

这一步发生了什么：含有总核酸的上分离层被转移到了一个新的Tube 管中。留下细胞碎片、蛋白质和其它有机成分。注意转移上分离层时避免吸到中间或底层溶液。

7、加入1.5ml SR3 溶液到水相分离层，涡旋混匀。4℃孵育10 分钟。

这一步发生了什么：第二次使用沉淀剂进一步去除蛋白质、细胞碎片。

8、室温2500g 离心10min。避开沉淀小球，转移上清到一个干净的15ml 收集管中（试剂盒提供）。

这一步发生了什么：含有核酸的上层溶液转移到了一个新的15ml 收集管中。剩下非核酸成分。

9、加入5ml SR4 溶液到含有上清液的收集管中，上下颠倒数次或轻轻涡旋混匀。室温孵育30min。

注意：原来的操作说明是‐20℃孵育30min。若你的土壤类型在‐20℃下孵育能获得理想的得率，请按照原方法进行。

10、室温2500g 离心30min。

11、轻轻倒掉上清，把15ml 收集管倒扣于一张吸水纸上，停留5 分钟。

注意：根据土壤类型，底部沉淀可能更大或更黑。

这一步发生了什么：SR4 为100%异丙醇。核酸形成沉淀后，弃去异丙醇。

12、SR5 使用前先摇匀。加入1ml SR5 溶液到15ml 收集管中。充分重悬沉淀。（注意：根据土壤类型，沉淀物有可能难于重悬。可45℃水浴10min，再稍微涡旋。重复直至充分重悬沉淀物。

这一步发生了什么：SR5 为的盐溶液，可重悬步骤14 沉淀下来的核酸。同时平衡RNA capture column 滤膜，为步骤16 的冲洗和步骤20 的洗脱做准备。

13、每个RNA 样品制备一个RNA capture column（试剂盒提供）：

a. 取下RNA capture column（试剂盒提供）的帽子，把RNA capture column 放入一个15ml 收集管中。Column悬挂于15ml 收集管中。

b. 加入2ml SR5 溶液到RNA capture column 中，让其自然流下，收集在15ml 收集管中。（注意：下一步加样前勿让column 风干。

14、把步骤12 获得的RNA 提取物加到RNA capture column 中，让其自然流下，收集在15ml 收集管中。

15、再加入1ml SR5 溶液 冲洗RNA capture column。让其自然流下，收集在15ml 收集管中。

这一步发生了什么：加到RNA capture column 中的核酸选择性吸附到column 滤膜上。再加1ml SR5 为了冲洗未被吸附的杂质，准备RNA 洗脱。

16、把RNA capture column 转移到一个新的15 ml 收集管中（试剂盒提供）。SR6 使用前摇匀。加1ml SR6 溶液到RNA capture column 中洗脱RNA。让SR6 自然流下收集在15ml 收集管中。

这一步发生了什么：SR6 洗脱缓冲液为的盐溶液，可选择性地把RNA 从column 滤膜上洗脱下来，留下DNA、残留的细胞碎片及抑制因子等。注意：一款新的试剂盒（货号：12867‐25）可把剩余的DNA 洗脱下来。

17、把洗脱下来的RNA 转移到一个2.2ml 收集管（试剂盒提供）中。加入1ml SR4 溶液。至少上下颠倒一次混匀。‐20℃孵育10min。

18、室温13000g 离心15min，沉淀RNA。

19、弃去上清，把2.2ml 收集管倒扣在吸水纸上晾干10min。

这一步发生了什么：SR4 为100%异丙醇。洗脱的RNA 沉淀、离心、晾干，然后重悬浓缩。

20、使用100μl SR7 溶液重悬RNA 沉淀物。

这一步发生了什么：SR7 为RNase/DNase‐Free 水，用于重悬沉淀的RNA。SR7 不含EDTA。此时RNA 可直接用于下游实验。为了延长RNA 的保存时间，可用10mM Tris pH8.0 代替SR7 重悬RNA。

（注意：对于大多数类型土样，*终RNA 中携带的DNA 并不明显。而有机物含量特别高的样品有可能增加

DNA 的污染。对DNA 污染比较敏感的情况下，可使用经过检测的引物做PCR 扩增。琼脂凝胶显示有DNA 条带的话，请参照疑难点中的DNase 处理。）

LifeGurad™ Soil Preservation Solution 操作说明

1、每克土样加入2~2.5 倍体积的LifeGurad™ Soil Preservation Solution。如1g 土样加入2~2.5ml LifeGuard™。若采样时直接把土壤加入到RNA PowerSoil™的 15mlBead Tube，2g 土样分量加5ml LifeGuard™。

注意：若处理的是沉积物等水分含量较高的样品，每克样品请加入3 倍体积的LifeGuard™。

2、涡旋或手动摇匀，使所有土样完全润湿。此时LifeGuard™溶液页面应该高于土样。

3、根据实际条件‐20℃、4℃或室温保存样品。提取 RNA 前2500g 离心5min，移除LifeGuard™溶液。

4、若直接使用15ml Bead Tube 收集样品，离心去除LifeGuard™溶液后直接进入RNA PowerSoil™ Total RNA IsolationKit 说明书步骤二继续。使用LifeGuard™保存的各种类型不同生物量和水分含量土壤已经成功通过测试。沉积物水份含量较高会稀释LifeGurad™，需要更大的体积比（3:1）。

生物量对在不同温度条件下LifeGuard 保存微生物群落结构的性能影响很大。对生物量未知或周围环境温度超过一般室温（22‐25℃）的情况下，应转移到‐20℃或4℃，或加大LifeGuard™使用比例（＞2.5ml LifeGuard/ g 土样）。长时间运输或保存土样（超过30days），请于‐20℃保存土样。

疑点难点

土样类型和加样量*终RNA 的得率和纯度取决于处理的土样类型。RNA PowerSoil™ Total RNA Isolation Kit 经过验证适合处理各种类型不同物理、化学、生物特性的土样。高有机物含量的样品，减少加样量至1g 能更好地平衡RNA 得率与DNA污染。根据我们的经验，对于大多数样品*多加样2g。沉积物可稍微多加样，我们曾经*多加样5g。提取过程中，步骤12 SR4 使用量可增至与裂解物体积一致（注意计算SR4 消耗量）。有些土样或沉积物盐分含量较高，步骤13 中可见明显的的白色或黄色盐沉淀。此沉淀会减少核酸提取得率。为了克服盐沉淀，加入SR4 后可室温孵育30min，取代原来的‐20℃孵育。其它操作步骤不变。

酚/lv仿/异戊醇液相分离

为了保证酚/lv仿/异戊醇与水相充分分离，步骤7 要在室温下2500g 至少离心10min。离心后，中间层的厚薄视土样有机物含量多寡而不同。转移上清时必须避免吸取中间层及底层。若吸取到了中间层或底层，重新离心已转移的水相层一遍，分离水相层。或往混有苯酚/中间层的水相中加入等体积（2ml）lv仿，上下颠倒数次或涡旋混匀，室温2500g 离心10min。转移上层水相，弃去下层苯酚/lv仿层。

SR5 重悬沉淀

高有机物含量的土样获得的RNA 沉淀可能难于重悬。45℃水浴加热RNA 沉淀有助于重悬。用枪头搅动沉淀或涡旋也能辅助重悬。进入步骤17 加样到column 前必须充分重悬RNA 沉淀。未能充分重悬RNA 沉淀会减少RNA吸附，降低其自然下流的速度，导致RNA 损失。

Column 冲洗洗脱

RNA Capture Column 中液体只能通过重力流下，不能使用离心机或真空泵抽吸。

使用RNase‐Free DNase 消化RNA

注意：只有RNase‐Free DNase 才使用于本操作说明。RNases 的存在会消化掉RNA。

对于绝大多数类型土样，RNA PowerSoil™ Total RNA Isolation Kit 不存在DNA 污染。但高有机物含量的土样，仍有可能提取RNA 的同时带有DNA 污染。请把下文操作说明与DNase 生产厂家的说明书结合，处理RNA。

a. 若一次处理RNA PowerSoil™ Total RNA Isolation Kit 得到的所有RNA，加入4 单位的DNase，加入适当的DNase缓冲液和水，定容至200μl。通常10X DNase 消化缓冲液为含10mM CaCl2、10mM MgCl2 的10mM Tris‐HCl缓冲液，pH7.5。

b. 37℃孵育30‐45min。

c. 计入200μl 酚/lv仿/异丙醇（pH6.5‐8.0），涡旋混匀。室温孵育5min

d. 10000g 离心5min。

e. 小心转移上层液相到另一Tube 管中。

f. 加入1/10 体积的5M NaCl，2 倍体积的100%乙醇，上下颠倒混匀。

g. ‐20℃孵育30min，10000g 离心10min。

h. 弃去上清，晾干沉淀小球。

i. 使用与沉淀一样体积的SR7 重悬小球。此时RNA 可不用稀释直接用于RT‐PCR 等下游实验。