RT-PCR实验操作过程

试验前注意：

1. 做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。

2. RT按要求做，一般不会出太大问题。

3. PCR如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。

试验过程：

实验器具：

1、 移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl

2、 吸头：1ml、200μl、20μl

3、 匀浆管：5ml

4、 吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个

5、 EP管：1.5ml、0.2ml、100μl

6、 试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶(广口，带盖)1个125ml的白色试剂瓶(放无水乙醇

7、 量筒：50ml、250ml、500ml

8、 容量瓶：250ml、500ml、1000ml

9、 试管架：5ml、1.5ml、20μl

10、 盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水

11、 铝制饭盒：4个

12、 塑料小饭盒：1个

13、 大瓷缸：2个

14、 锡泊纸：一卷

15、 卷纸：2卷

16、 三角烧瓶：带盖，稍大

实验器具的处理与准备：

1、 塑料制品：(包括枪头、EP管、匀浆管等)先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次(EP管)。

2、 玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用(DEPC水泡)(洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干)。

3、 匀浆器：(包括剪刀、镊子)先洗净后，再高压(不需要泡DEPC

试验试剂：

1、 DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。

2、 75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高压)。

3、 异丙醇：放入棕色瓶中。

4、 氯仿：放入棕色瓶中。

5、 琼脂糖

几种缓冲液的配制：

1、 电泳缓冲液： Tris? ?54g??硼酸 27.5g 0.5M EDTA 20ml pH8.0 蒸溜水 1000ml。

2、 5×TBE (贮存液)再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用(即工作液浓度)，如取50ml贮存液加入450ml水——→500ml工作缓冲液。

3、 上样缓冲液：0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 30%甘油 6×缓冲液，4℃保存。


RT-PCR实验操作过程

原创作者：南京信帆生物技术有限公司