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资料下载

谷胺酰胺合成酶(GS)试剂盒说明书

点击次数: 1381发布时间:2011/3/7

  • 上 传 者: 南京信帆生物技术有限公司
  • 上传时间: 2018/7/9 17:17:32
  • 文件大小: 58KB
  • 文件类型: jpg
  • 所属分类: 其它资料
  • 下载次数: 483次
  • 查看次数: 1381

资料简介: 测定原理


GS 在ATP 和Mg2+存在下,催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺;谷氨酰胺进一步转化为γ─
谷氨酰基异羟肟酸,在酸性条件下与铁形成红色的络合物;该络合物在540nm 处有吸
收峰,可用分光光度计测定。

所需的仪器和用品

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、
研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

提取液:100mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:10mL×1 瓶,-20℃保存。
试剂二:10mL×1 瓶,-20℃保存。
试剂三:粉剂×2 瓶,-20℃保存。用时每瓶加入5mL 蒸馏水充分溶解备用,用不完的试剂仍
-20℃保存。
试剂四:15mL×1 瓶,4℃保存。

样本测定的准备

1、细菌、细胞或组织样品的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为500~1000:1 的比例(建议500 万细菌或细胞加入1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30 次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10 的比例(建议称取约0.1g 组织,加入1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样品:直接检测。
 
GS 活力单位的计算

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清(浆)GS 活性
单位定义:每mL 血清(浆)在每mL 反应体系中每min 使540 下吸光值变化0.01 定义为一个酶活力单位。

计算公式:
GS(U/mL)=ΔA×V 反总÷V 样÷0.01÷T =19×ΔA

2、组织、细菌或细胞GS 活性

(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg 组织蛋白在每mL 反应体系中每min 使540nm 下吸光值变化0.01 定义为一个酶活力单位。GS(U prot)=ΔA×V 反总÷(Cpr×V 样)÷0.01÷T =19×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g 组织在每mL 反应体系中每min 使540nm 下吸光值变化0.01 定义为一个酶活力单位。GS(U/g 鲜重)=ΔA×V 反总÷(W× V 样÷V 样总)÷0.01÷T =19×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算
单位定义:每1 万个细菌或细胞在每mL 反应体系中每min 使540nm 下吸光值变化0.01 定义为一个酶活力单位GS(U/104 cell)=ΔA×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷0.01÷T =0.038×ΔAV 反总:反应体系总体积,0.4mL; V 样:加入样本体积,0.07mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,30 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。 

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