Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳区分不同的蛋白质组分，并将所分离的蛋白质转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或荧光标记的第二抗体起反应，经过底物显色或激光扫描以检测目的蛋白表达水平。  

<b> 2实验设备</b>

　　多功能酶标仪、电泳设备、转膜设备、脱色摇床、湿盒、扫描设备等。

<b> 3 试剂与耗材</b>

　　配胶试剂：30%丙烯酰胺、1.5M PH8.8Tris、1M PH6.8Tris、10%AP、10%SDS、TEMED、双蒸水等。

　　电泳液：1L 3.03gtris 18.8g甘氨酸 1gSDS。

　　转膜液：1L 3.03gtris 14.4g甘氨酸 200ML甲醇。

　　封闭液：5%脱脂奶粉或3%BSA+2%脱脂奶粉。

　　2×蛋白LOADING：100mmol/L tris-cl,4%SDS,20%甘油，0.2%溴酚蓝，200 mmol/L DTT。

　　BCA定量试剂盒，蛋白预染MARKER，抗体孵育板，NC膜，3MM滤纸等。

<b> 4 操作步骤</b>

　　<b>4.1蛋白样品制备</b>

　　（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取

　　①倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。  

　　②每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。  

　　③按1ml裂解液加10 μl PI（SIGMA P8340），摇匀置于冰上。（PI要无结晶时才可与裂解液混合。）

　　④每瓶细胞加400 μl含PI的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。  

　　⑤裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）  

　　⑥于4℃下12000rpm离心10min。（提前开离心机预冷）  

　　⑦将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于－20℃保存。  

<b>　　</b>（2） 组织中总蛋白的提取：  

　　①将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。  

　　②加400 μl单去污剂裂解液裂（含PI）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。  

　　③几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。  

　　④裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心10min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。  

<b>　　</b>（3） 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：<b> </b>

　　由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：  

　　① 将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。  

　　②弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。  

　　③ 用枪吸干上清后，加100 μl裂解液（含PI）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。  

　　④将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。  

　　（4）也可以直接用2*loading（100mmol/L tris-cl,4%SDS,20%甘油）抽提，培养皿细胞经PBS洗涤2-3次，35MM皿加30-50ul，60MM皿加100-200ul。如是培养瓶可将细胞消化、洗涤后，清弹EP管使细胞松散后加适量裂解液。收集样品于100度变性5-10min、短暂离心冻存待用。

<b>　　4.2蛋白含量的测定</b>

　　本试剂盒是在BCA法蛋白浓度检测基础上改进而成的。碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+， Cu+与BCA试剂形成紫色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。步骤简单，45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便。灵敏度高，检测浓度下限达到25μg/mL，*小检测蛋白量达到0.5μg，待测样品体积为1-20μl 。BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的去污剂等化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20，60，80，但螯合剂(EDTA，EGTA)、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类会对检测结果有一定影响。

<b>　　4.3 SDS－PAGE电泳</b>

　　（1） 清洗玻璃板：  

　　一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。  

　　（2） 灌胶与上样  

　　 ①玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）  

　 　②按配方配分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用移液器吸取胶沿玻璃壁加入，待胶面升到绿带下沿时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）  

　 　③当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。  

　　 ④按配方配5%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。  

　 　⑤用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）  

　　 ⑥测完蛋白含量后，计算含50ug蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5ml离心管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。（上样总体积一般不超过15ul，加样孔的限度可加20ul样品。）上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性。  

　 　⑦加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。  

　　（3） 电泳  

　　电泳时间一般1～2 h，电压为80V较好。电泳至需要检测的目的蛋白被分离开（可参照预染蛋白MARK）便即可终止电泳，进行转膜。  

<b>　　4.4转膜</b>

　　（1） 转一张膜需准备4张5.0～8.5cm的滤纸和1张5.0～8.5cm的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸湿才可使用。（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。  

　　（2） 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、滤纸和浸过的膜。  

　　（3） 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，在垫子上垫两层滤纸，注意不要有气泡。  

　　（4） 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶置于转膜液中平衡5min，用手调整使胶置于滤纸中央。将膜盖于胶上，注意不要有气泡。在膜上盖2张滤纸。*后盖上另一个海绵垫。整个操作在转移液中进行。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。）  

　　（5） 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用80V转移1 h或60V转移2 h。  

<b>　　4.5 免疫反应</b>

　　（1） 将膜移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。  

　　（2） 将一抗用封闭液稀释至适当浓度（在1.5ml离心管中）；将抗体稀释液滴加在孵育板上，在将膜扣在上面，室温2-3h或4度过夜。

　　（3） 用PBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min。  

　　（4） 同上方法准备二抗稀释液并与膜孵育，室温下孵育1～2h后，用PBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min。  

<b>　　4.6激光扫描</b>

　　4.6.1仪器的操作流程：

　　（1）在面板上打开仪器电源开关，再开启电脑，关机时相反。

　　（2）用软布或无尘纸蘸双蒸水将扫描平面的玻璃擦拭干净。

　　（3）将要扫描的胶或膜放到扫描平面上，记下坐标，扣上舱盖。

　　（4）双击软件图标，输入用户名、密码，进入主菜单。

　　（5）点击scan快捷键，选择要扫描的区域、介质、通道及合适的灵敏度、分辨率，开始扫描。

　　（6）扫描结束后对扫描结果进行分析。

　　（7）依次进行图象裁切、定道、定分子量标准、背景扣除等操作。

　　（8）根据需要输出图形或数据报告表格。

　　4.6.2扫描操作流程

　　（1）打开软件，点击“File”栏中的“New”创建一个新项目（如果是在已有项目中添加新内容，则点击“File”栏中的“Open”，打开已有项目）。

　　（2）在窗口“New Project”中设定项目文件存储的路径和项目名称。

　　（3）点击“Scan”按钮创建该新项目。

　　（4）在登陆窗口输入用户名和密码。

　　（5）点击“OK”按钮，进入扫描控制窗口。

　　（6）在“Name”栏输入该次扫描的名称。

　　（7）在“Group”栏选择用户所属的组。

　　（8）在“Preset”栏选择目前进行扫描的介质（eg：膜还是胶？）。

　　（9）选择合适的分辨率，扫描质量和焦距（对于膜来说，一般选择分辨率为169，扫描质量为medium，焦距为0，假如是胶，焦距为胶厚度的1/2）。

　　（10）在“Channels”栏根据所用二抗标记的荧光选择合适的通道，700或800或两者皆选，每个通道的激光强度可分别在“Intensity”栏调节。

　　（11）扫描控制窗口的右下侧矩形框为扫描区域，根据待扫描的膜的位置调节红色矩形框，使其将膜的区域完全覆盖（注意：膜或胶一般均放置在扫描平面的左下方）。

　　（12）扣上舱盖开始扫描。

　　（13）点击“Alter Intensity”按钮可以根据需要分别调节两个通道的亮度，对比度和灵敏度，调节好后点击“OK”按钮确认。

　　（14）扫描结束后，图片会自动弹出，保存扫描图片。