讲解ELISA试剂盒的正确操作步骤

 信帆生物提供高灵敏度，特异性好，即用型的ELISA试剂盒，长期与全国各大高校合作，引用文献上千篇。

ELISA试剂盒包含预包被酶标板、检测抗体、链酶亲和素标记的HRP、标准品、TMB显色液、终止液、洗液、封板膜、检测缓冲液等10个成分。

ELISA在操作前试剂和组分都先恢复到室温，标准品、质控品和样品，建议做复孔。ELISA缓冲液配制
吸取5毫升10x Assay Buffer缓冲液，至50ml离心管，吸取50ml20x洗液至1升量筒，加蒸馏水至1000毫升。
加样注意事项：
取出已恢复至室温的酶标板，加入300微升洗液，以洗去包被抗体保护剂，使包被抗体处于*佳活性状态，静置浸泡30秒。洗板结束后，立即使用酶标板，不要让酶标板干燥。
排版布局H1、H2孔为空白孔，A1、A1至G1、G2为标准曲线的S1至S7孔，每孔加入50微升的Assay Buffer，根据排版，每孔加入50微升标准品和样本，加样时，垂直悬空加入液体，加完后枪头轻轻碰液面（建议标准品，样本都做复孔），*后每孔加入50微升检测抗体，加完后用封板膜小心封好酶标板，为让抗原抗体充分接触。

洗涤注意事项：

洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却决定着实验的成败。ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA 操作中，洗涤是主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。

计算方法：

检测完成后，以标准品浓度做为纵坐标，对应的吸光度（OD值）作为横坐标，利用计算机软件，采用四参数Logistic曲线拟合（4-pl），创建标准曲线方程，通过样本的吸光度（OD值），利用方程计算样品的浓度值。如果样品被稀释，通过上述方法测的的浓度值，要乘以稀释倍数，才是样品的终浓度。

抄笔记总结：

1.  从室温平衡60min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.  设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.  待测样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；

4.  随后标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.  弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

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