维生素B2检测试剂盒(荧光光度法)的操作步骤

产品简介:

维生素 B2(Vitamin B2)又称核黄素，是一种异咯嗪衍生物，耐热、微溶于水，中性水溶液及乙醇溶液呈黄色，具有很强的荧光，在 pH 值 6~7 的溶液中荧光*强，在 pH=11时荧光消失，核黄素可被还原性物质还原为无色的二氢化物，同时失去荧光;二氢化物在空气中易重新氧化，恢复其荧光。维生素 B2检测试剂盒(荧光光度法)是利用 Vitamin B2的中性溶液有强荧光当加入有还原性的亚硫酸盐时，核黄素被还原为无荧光的物质，根据稀核黄素溶液在还原前后荧光强度的变化即可定量检测 Vitamin B2的含量，其激发波长为 440~500nm(多为460nm),发射波长为 510~550nm(多为 520nm)。该试剂盒仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。

自备材料

1、待测样品如青菜、水果、牛奶、药品等

2、蒸水、稀盐酸或氢氧化钠(0.1mol/L)

3、精密天平、今浆器、pH计或 pH试纸、离心机

4、离心管、维形瓶、容量瓶

5、高压灭菌锅或恒温水浴锅、荧光分光光度计

操作步骤(仅供参考):

1、稀释组织匀浆液: 取适量的组织匀浆液(10x)，按组织浆液(10x): 蒸水=1:9 的比例稀释，获得 1x组织匀浆液，待用

2、样品准备:

a)固体样本:准确称量 2~10g 样品置于研磨器内研磨，加入少量 1x组织浆液，研磨碎留取上清，再次用 1x组织匀浆液研磨，*后一并倒入 50ml维形瓶，加入1x组织匀浆液至40ml，充分摇匀，置于高压灭菌锅内，121C下保持 30min，冷却至室温后用稀氢氧化钠

调 pH 值至 6.0~6.5，用1x组织浆液定容至 50ml; 如样品杂质较多，可在氧化钠调至6.0 后立即用稀盐酸再调 pH 值至 4.5,4000g 离心 5min 或者过滤，上清液或滤液再调 pH值至6.0~6.5，定容，滤液 4C保存备用。b)液体样品 : 牛奶、饮料等液体样品，取 5ml牛奶于 50ml 形中，加入 1x组织匀浆液至 40ml，以下操作同上

3、稀释标准品: 取适量的 Vitamin B,标准(100pg/ml)，按 Vitamin B,标准(100pg/ml):蒸水=1:9 稀释成 Vitamin B,标准(10pg/m)4C保存注意 :Vitamin B,标准(100Pg/ml)需要充分溶解混匀，否则会导致标准值不准确。

制备亚硫酸盐工作液 :取一支亚硫酸盐 100mg 粉末，充分解于 2m 蒸水，即配制成 50mg/ml的亚硫酸盐工作液，即配即用，冰水浴保存，4 小时内有效，也可以用精密天平自行称量落解。

5、Vitamin B,检测 :选用恰当的滤色片，核黄素测定的激发波长为 460nm，发射波长为520nm，提前预热仪器 30min，蒸水调零，以下表 6号管作参比洛液调荧光分光光度计的荧光强度读数到满刻度(100%) 分别测定其他标准洛液和样品溶液的相对荧光强度，在测定中如果样品溶液的荧光强度大于 100%，需要释后再行测定测定加入亚硫酸盐工作液前后的荧光值，分别记为 F。和F。加入亚硫酸盐后，应立即混匀，并在 20s 内测出各管荧光值

以各管 Vitamin B标准的浓度(ug/ml)或含量(ug)为横坐标，以对应的校正后的荧光强度(F)为纵坐标，做出 Vitamin B标准曲线

根据 Vitamin B标准曲线及样品管的校正后的荧光强度(F)即可计算出待测样品中Vitamin B,的实际浓度和含量。

100ml液体样品中 Vitamin B含量(g/100ml= CxVx100N100g 固体样品中 Vitamin B含量(g/100g)=CxV;x100/m

式中: C=待测样品中 Vitamin B的浓度(g/ml)

V,=检测体系中加入的滤液体积(ml)=5

V,=液体样本滤液的总体积(ml)= 50

V;=固体样品的上清液总体积(ml)= 50m=固体样品的质量(g)

注意事项:

1、 Vitamin B,见光易分解，在上述操作中，应严格避免阳光直射

组织匀浆液为酸性，有腐蚀性，应小心操作。2、

待测样品如不能及时测定，应置于 2~8”C避光保存3 天内稳定3Vitamin B,在碱性溶液中不稳定，因此在加稀氢氧化钠调 pH 值时应边加边摇，防止4.局部碱度过大，破坏 Vitamin B2。

样品提取液中如有色素，会吸收部分荧光，需要使用高锰酸钾氧化除去色素Vitamin B不易被中等氧化剂或还原破坏，但有 Fe2”存在时，可被过氧化氢破坏7含核黄素的标准品或样品一旦加入亚硫酸盐后会因产生二氢化物失去荧光，但二氢化物在空气中又易重新氧化，恢复荧光，因此应在 10min 内检测完毕，而且越快越好.8、 如果样品浓度过高，应用蒸馏水稀释后重测，结果乘以稀释倍数

有效期 :6 个月有效;4C运输，4C保存.

 维生素B2检测试剂盒(荧光光度法)的操作步骤