浓缩汁样品接种操作程序

1．将样品表面（指容器表面）用75%酒精棉球消毒后，连同做样中用的灭菌缓冲稀释液（每个锥形瓶含90ml）、抽滤瓶、冲洗水（用于冲洗膜器,不含干扰纯培养的菌类的清水）、自来水（用于冷却水浴后的样品液）、灭菌的膜过滤器（可用高压蒸汽灭菌法，也可将干燥的膜滤器置于超净台上接受紫外线照射杀菌）、灭菌滤膜（先用75%酒精浸泡消毒，再浸泡于无菌水中）、灭菌的平皿和吸管（装于铜筒中于160℃恒温干燥箱中灭菌1h）及锥形瓶、消毒棉球、装有灭菌培养基的容器、灭菌纱布等拿入无菌室。然后打开超净工作台电源开关，再依次打开超净台、无菌室、缓冲间的紫外灯，对拿入的物品表面及室内空间进行灭菌。

2．紫外线照射1h后，依次关闭缓冲间、无菌室、超净台的紫外灯，同时开启超净台风机，接通水浴锅电源，设定温度为80℃。出来时将需要加热或融化的培养基拿出并于电炉上加热。

3．约20min后，将电炉加温的培养基组A和加热完全融化的固体培养基拿入无菌室，置于水浴锅上保持其熔融状态。

4．用香皂洗净手，穿戴好工作服、帽、嘴巴罩，换鞋后进入无菌室，用消毒棉球对手包括手腕及指甲缝中进行仔细擦拭消毒至少2min。

5．在超净工作台上将组A倒入组B中并充分混合，待不烫手后将混合培养基倾入几个灭菌平皿中，每个以15~20ml为宜，制成平板，放凉备用。

6．将天平至调至平衡，取一并无菌稀释液轻置于左盘中，然后用镊子给右盘上添加砝码并调节天平刻度旋钮至横梁重新平衡后，再补加10g砝码重量。

7．用灭菌剪刀在小无菌袋上适当位置剪一小口，然后用10ml灭菌吸管吸取足量浓汁放放天平左盘上的无菌稀释液中至天平重新平衡（即试样量为10g，制成1稀释液），然后打开平皿盖，并使其与平皿底呈45度角，将吸管中剩余果汁分别放入灭菌平皿中，每个平皿接种1ml（有时根据实际需要可以增多或减少试样量；有时也可进行1∶10、1∶100等更大稀释度的检测）用于“菌落总数”或“酵母＆霉菌”的检测培养。盖好平皿盖，用特种铅笔作上样品名称、检样量和做样时间等标记。

8．轻轻将天平上的样品稀释液取下，塞上塞子和包扎纸，摇匀后，浸入到80±1℃水浴锅中（水位蕞好不低于锥形瓶中样品稀释液的液位）加热杀菌10min。加热过程中要对样品稀释液进行振摇以加快传热。

9．将水浴杀菌好的样品稀释液从水浴锅中移至自来水中冷却备用。

10．重复6~9步骤做下一个样品。

11．将放凉至不烫手且尚在熔融状态的平板计数琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基倾入到相应的含有试样的平皿中，每个平皿中约倒入培养基15~20ml，立即将盖好盖的平皿朝同一方向快速水平转动振摇，使样品充分混匀到培养基中。

12．在超净工作台上，将灭菌的膜过滤器水平安置在抽滤瓶上，用灭菌镊子将滤膜置于过滤器滤板上，并避免侧漏。从冷水中取出样品稀释液，用干纱布擦去瓶壁上的水分，然后将样液小心地倾入膜过滤器中，加盖后（可用75%洒精棉球将盖内面擦湿以加强所密性，防止微生物侵染），用真空泵抽滤干净。

13．将抽滤瓶放回到超净台上，打开膜过滤器，用灭菌镊子夹紧滤膜边缘（过滤区外围），将其截留面朝上帖放在耐热菌培养基平板上，并与平板良好接触，之间不得存有空气。

14． 重复12、13步骤，抽滤下一个样品稀释液。注意在抽滤下一个样品稀释液前，当估计到上一个样品稀释液中耐热菌的数量少到不影响下一个样品稀释液的检测结果时，可直接置膜抽滤下一个样品稀释液。否则，应用装在洗瓶中的净水冲洗一下膜过滤器，并对镊子灼烧灭菌后（也可用0.2%新洁尔灭溶液对其工作部位杀菌），再给膜过滤器放置下一张滤膜。

15．用灭菌吸管吸取40ml浓汁样品注入到灭菌锥形瓶中，加入3.5ml15%的灭菌的碳酸钠溶液，调其pH为中性或接近于中性。然后按GB/T4789.3规定进行大肠菌群测定。接种量选择10ml、1ml、10^－1ml。

16．待全部样处理完毕，切断水浴锅电源，关闭超净台风机及电源。立即将所有已冷却的培养皿拿出无菌室，按不同培养目的分别倒置放入设置为不同温度恒温培养箱，在不同条件下培养。（如果是平板涂布法接种的培养皿则应先正放几小时待接种的样液较为干燥后再倒置）。

17．清理无菌室，清洗用过的物品。（蕞好不用洗洁精清洗锥形瓶，以避免残余的清洗剂对下一次检测样液中可能存在的微生物发生抑制作用。）

18．填写微生物检验原始记录表。