染色方法

　　微生物染色方法一般分为单染色法和复染色法两种。前者用一种染料使微生物染色，但不能鉴别微生物。复染色法是用两种或两种以上染料，有协助鉴别微生物的作用。故亦称鉴别染色法。常用的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法，此外还有鉴别细胞各部分结构的（如芽胞、鞭毛、细胞核等）特殊染色法。食品微生物检验中常用的是单染色法和革兰氏染色法。

１、单染色法

　　用一种染色剂对涂片进行染色，简便易行，适于进行微生物的形态观察。在一般情况下，细菌菌体多带负电荷，易于和带正电荷的碱性染料结合而被染色。因此，常用碱性染料进行单染色，如美兰、孔雀绿、碱性复红、结晶紫和中性红等。若使用酸性染料，多用刚果红、伊红、藻红和酸性品红等。使用酸性染料时，必须降低染液的PH值，使其呈现强酸性（低于细菌菌体等电点），让菌体带正电荷，才易于被酸性染料染色。

　　单染色一般要经过涂片、固定、染色、水洗和干燥五个步骤。

　　染色结果依染料不同而不同：

　　石碳酸复红染色液：着色快，时间短，菌体呈红色。　　

　　美兰染色液：着色慢，时间长，效果清晰，菌体呈兰色。

　　草酸铵结晶染色液：染色迅速，着色深，菌体呈紫色。

２、革兰氏染色法

　　革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。

　　细菌先经碱性染料结晶染色，而经石典液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G—）。为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。有芽胞的杆菌和绝大多数和球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应。

　　革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生里性质上有很多差别，染色反应不一样。现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与石典和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度底，吸附染料差，易脱色，这是染色反应的主要依据。

　　另外，阳性菌菌体等电点较阴性菌为低，在相同PH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料很多，因此不易脱去，阴性菌则相反。所以染色时的条件要严格控制。例如，在强碱的条件下进行染色，两类菌吸附碱性染料都多，都可呈正反应；PH很低时，则可都呈负反应。此外，两类菌的细胞壁等对结晶紫—石典复合物的通透性也不一致，阳性菌透性小，故不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色。所以脱色时间，脱色方法也应严格控制。

　　革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：

　　１）涂片固定。

　　２）草酸铵结晶紫染1分钟。

　　３）自来水冲洗。

　　４）加石典液覆盖涂面染1分钟。

　　５）水洗，用吸水纸吸去水分。

　　６）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗，吸去水分。

　　７）蕃红梁色液（稀）染10秒钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。

　　染色的结果，革兰氏正反应菌体都呈紫色，负反应菌体都呈红色。