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MMP-2&MMP-9明胶酶谱法检测试剂盒操作步骤详解！
点击次数：734发布时间：2018/6/12
MMP-2&MMP-9明胶酶谱法检测试剂盒操作步骤详解！
相关简介：
基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以无活性的酶原形式分泌，活化后能够降解细胞外基质的胶原蛋白，又称胶原酶。通过影响细胞外基质，胶原酶参与胚胎发育、形态发生、组织重塑等过程，并参与炎症、肿瘤、心血管、神经等许多疾病过程。血浆与组织中的MMP-2、MMP-9参与各种生理与病理过程，其在临床诊断和治疗中的意义日益受到重视。检测步骤：
5.1 制备含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝胶：推荐分离胶浓度为8%。按照标准程序制备SDS PAGE凝胶。将10 × substrate G 融化，并90 ºC 加热5分钟。分别在浓缩胶和分离胶中额外加入10 × substrate G并使之稀释10倍，混匀后加入过硫酸铵和TEMED，等待凝胶聚合。
5.2 待测样品1:1 稀释于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mMTris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上样。切勿加热变性，并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液。可通过预试验确定加样量，使用普通蛋白预染Marker 即可。阳性对照(可选步骤)：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血与100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer等体积混合，取5-15μl 上样。
5.3 低电流恒流电泳，每一块小胶电流为20 mA/gel。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。
5.4 洗涤凝胶：取出凝胶，去除浓缩胶，放入容器内。可先用适量蒸馏水冲洗凝胶，然后加入10 ml 1× Buffer2A(用蒸馏水稀释)，室温漂洗凝胶2 × 30 分钟。中间换液。
5.5 孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸馏水稀释)，室温或37ºC 孵育1~5 小时。阳性对照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小时即可显示。如MMP 活性低，应延长孵育时间为10小时或过夜。
5.6 显色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液（操作步骤见后面所附SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书）。凝胶的大部分区域被深染，在有MMP 条带的位置不被染色而形成透亮区域。透明区域的位置和范围指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及活性。阳性对照将在66~72MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出现透明条带。
5.7 条带扫描：将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然MMP条带透明，但凝胶背景并非真正全黑。解决办法：可
MMP-2&MMP-9明胶酶谱法检测试剂盒操作步骤详解！
特点：
1.专一性强。抗原与抗体的免疫反应是专一反应，而免疫酶技术以免疫反应为基础，所检测的对象是抗原（或抗体），使用的抗体除标记了酶以外，与普通抗体的免疫反应特性并无多大差别。
2.灵敏度高。由于抗体联结上了酶，因此，借助于酶与底物的显色反应，显示抗原与抗体的结合，大大提高了检测的灵敏性，使检测水平接近放射免疫测定法。
3.样品易保存。经过酶反应显示的有色产物大多比较稳定，因此有利于样品的保存
4.结果易观察。对检测结果即可用肉眼观察，又可用显微镜观察，也可以用分光光度计进行比色测定，还可用显微镜观察。这是因为某些酶反应产物能使电子密度发生改变，从而引起被检测物的显示。
5.可以定量测定。溶液中的抗原物质，应用酶免吸附技术进行比色测定，依据光密度值的变化，可以定量。预计用细胞分光光度计可对组织内的抗原进行免疫酶技术的定量测定。
6.可以大规模测定样品。如有成千上万份样品需要进行检测，免疫酶技术都能在较短时间内完成。
7.仪器和试剂简单。对免疫没技术来说，不需要荧光显微镜，也不需要测定放射性的特殊仪器，所用仪器及试剂均属一般性仪器与试剂，普通实验室及生产应用单位均易购置。
购买过我司明胶酶谱法MMP-2/9检测试剂盒发表的相关文献标题。
《绿茶多酚EGCG增强动脉粥样硬化斑块稳定性及其相关机制研究》
相关内容如下：
免疫组织化学染色发现EGCG组斑块中巨噬细胞比例明显降低,而斑块中平滑肌成分显著增高。此外,Western blot检测发现EGCG可以显著降低ApoE缺陷小鼠斑块中基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)的表达。同样,明胶酶谱法结果提示EGCG组斑块中MMP-2和-9活性较对照组明显减低。zui后,与对照组相比,EGCG腹腔注射后,ApoE缺陷小鼠血清炎症因子MCP-1、IL-6、TNF-α以及IFN-γ水平显著降低。结论:本研究结果提示,绿茶多酚EGCG能够增强高脂饮食喂养ApoE缺陷小鼠动脉粥样硬化斑块稳定性。此外,EGCG增强斑块稳定性的内在机制可能与其抑制多种炎症因子、基质金属蛋白酶诱导因子以及机制金属蛋白酶表达有关。
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