Bradford法蛋白浓度检测试剂盒操作要点

考马斯亮兰 G-250 染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的zui大吸收峰的位置（Imax），由 465nm 变
为 595nm，在定的浓度范围内，测定的吸光度值 A595 与蛋白质浓度成正比。Bradford 法测定蛋白浓度不受
绝大部分样品中的化学物质的影响，样品中巯基乙醇的浓度可高达 1M，二硫苏糖醇的浓度可高达 5mM，但受
略高浓度的去垢剂影响，需确保 SDS 的浓度低于 0.1%，Triton X-100 低于 0.1%，Tween 20, 60, 80 低于 0.06%。
含去垢剂的样品推荐使用索莱宝生产的 BCA 蛋白浓度测定试剂盒。

操作说明：
 

．微孔酶标仪法
1. 完全溶解蛋白标准品，取 10ul，稀释至 250ul ，使终浓度为 0.2mg/ml。待测蛋白样品在什么溶液中，
标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用 0.9%NaCl 或 PBS 稀释标准品。
2. 5×G250 染色液使用请颠倒 3-5 次混匀，取 1ml 5×G250 染色液，加入 4ml 双蒸水，混匀成 1×G250
染色液，此 1×G250 染色液可在 4℃保存周。
3. 将标准品按 0,2,4,6,8,12,16,20 微升分别加到 96 孔板中，加 PBS 稀释液补足到 20 微升。
4. 将样品作适当稀释（多做几个梯度，如作 2 倍、4 倍、8 倍稀释），加 20 微升到 96 孔板的样品孔
中。由于移液器在取小量时的误差，标准线面的点可能不很准确，所以尽可能的让样品点落在标准线 1/2 后。
5. 各孔加入 200 微升稀释后的 1×G250 染色液，室温放置 3-5 分钟。
6. 用酶标仪测定 A595，或 560-610nm 之间的其它波长的吸光度。
7. 根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。
 

二．分光光度计法
 

如无酶标仪，染色反应可在离心管中进行，反应液混匀后加入比色皿中，使用分光光度计测定吸光值。