RND99009

1．概述

    REAGEN™氟喹诺酮类酶联免疫反应测试盒为养殖者和政府监督管理部门提供了灵敏度为0.1ppb的快速检测技术。该试剂盒有以下特点：

Ø 快速。10-30分钟之内可完成从鸡蛋，组织，饲料，尿液，牛奶中提取氟喹诺酮的全过程且回收率达到75-105%。

Ø 高重现性。

Ø 快速的检测（在不考虑样品数量的情况下只需不到2小时）。

2．试剂盒原理

REAGEN™氟喹诺酮类酶联免疫反应测试盒基于竞争性酶联反应原理，含有氟喹诺酮的抗原抗原已经包被于微孔板上。药物分析时，样品同特异性一抗共同被添加到板孔中。如果样品中含有药物，会竞争一抗，抑制抗体与板上包被的药物抗原结合。加入酶标记的二抗，形成包被抗原-抗体-酶标二抗复合物。加入底物后，产物的颜色强弱与样品中氟喹诺酮的浓度成反比。

3.试剂盒组成

已包被抗原的酶标板(Fluoroquinolone-coated Plate)（可拆式） 12×8孔

标准液(Standards)（0，0.1，0.25，0.5，1.0，5.0ppb）6×1.0mL

回收用10ppb标准液（Spiking）1×1.0mL

氟喹诺酮一抗(Fluoroquinolone Antibody #1)1×15mL

100×HRP酶标二抗(HRP-Conjugated Antibody #2)1×250µL

酶标二抗稀释液(Antibody #2 Diluent)1×20mL

10×样品提取液(Sample Extraction Buffer)1×25mL

20×浓缩洗液(Wash Solution)1×30mL

终止液(Stop Buffer)1×14mL

TMB底物(TMB Substrate)1×10mL

本试剂盒应当在2-8℃的温度下储存，有效期为一年。如果超过3个月不使用试剂盒，

请将一抗和二抗放置-20℃或者冰冻保存。

4.检测限

5.交叉反应

6．未提供的设备或材料

1) 酶标仪

2) 恒温培养箱

3) 匀质器

4) 漩涡振荡器

5) 移液器(10、20和100mL，1mL各一支)

6) 多道移液器（50-300mL）

7.注意事项

实验前请阅读以下文字，以保证获得*佳实验效果。

1) 标准品中含有恩诺沙星，请小心使用。

2) 不要使用过期的试剂盒。

3) 不同批次的试剂盒不要混用，抗体和微孔板具有盒与批次的特异性。确保二抗及二抗稀释液正确配制。

4) 尽量保持室温20-25℃，避免在通风口操作防止温度过低，过热和/或者蒸发。同样的，不要在阳光直射下实验，防止过热及蒸发。在孵育期间，如果工作台温度过低，应该铺垫若干纸巾或者其他物料。

5) 水质量很重要，确保使用蒸馏或者去离子水。

6) 加入样品或者试剂到空的微孔板时，吸嘴靠于微孔接近底部，并保持接触。

7) 孵育时间的计算越规范越好，保持添加标准品的一致性，先添加标准品后添加样品。

8) 从低浓度到高浓度地添加标准品，降低影响标准品曲线质量的风险。

9) 将微孔板置于放有干燥剂的密封袋中，冷藏保存。

8．试剂的准备

所有的试剂在使用之前应将其回温至室温，并在使用试剂前摇动几下，以保证合理的浓度。

（1）1×二抗工作液

按1：99的比例来配制二抗浓缩液和二抗稀释液，配成二抗的工作液。举例：取100ul 100X酶标二抗加入到9.9ml二抗稀释液中，配制成10ml的1X二抗工作液，按需要，可同比例放大或缩小。

（2）1×工作洗液

按1：19的比例配制浓缩洗液和双蒸馏水。举例：取10ml的20X浓缩洗液加入到190ml双蒸馏水中，配制成200ml的1X工作洗液，按需要，可同比例放大或缩小。

（3）1×样品提取液

按1：9的比例配样品提取浓缩液和双蒸馏水。举例：取1ml的10X样品提取液加入到

9ml双蒸馏水中，配制成10ml的1X样品提取液，按需要，可同比例放大或缩小。

（4）35%甲醇/样品提取液（用于检测尿样、牛奶和蜂蜜）

混合6.5体积1×样品提取液和3.5体积100%甲醇。举例：取35ml100%甲醇加入到65ml 1X样品提取液中，配制成100ml的35%甲醇/样品提取液，按需要，可同比例放大或缩小。

（5）70%甲醇

     按7：3的比例配制无水甲醇和双蒸馏水。举例：取70ml无水甲醇加入到30ml双蒸馏水中，配制成100ml的70%甲醇。按需要，可同比例放大或缩小。

9．样品的准备

1）蛋

（1） 1g匀质样品中加入4mL70%的甲醇；

（2） 涡旋2分钟；

（3） 室温（22.5±2.5）°C下4000g离心5分钟；

（4） 移取0.5mL上清液，加入0.5mL1×样品提取液，混合均匀；

（5） 每孔取50µL用于检测

     稀释倍数：10.0

2） 饲料

（1） 1份样品中加入5份70%的甲醇（如1g样品+5mL70%甲醇），匀质；

（2） 取1.5g匀质样品，室温（22.5±2.5）°C下4000g离心5分钟；

（3） 移取0.5mL上清液，加入0.5mL1×样品提取液，混合均匀；

（4） 每孔取50µL用于检测

     稀释倍数：10.0

3） 肌肉/肝脏/肾脏/鱼类/虾

（1） 去除样品中的脂肪，对样品进行匀质；

（2） 取1.0g匀质样品，加入4mL70%甲醇；

（3） 涡旋震荡10分钟；

（4） 室温（22.5±2.5）°C下4000g离心5分钟；

（5） 移取0.5mL上清液，加入0.5mL样品提取液，混合均匀。

（6） 取 50µL用于检测

稀释倍数：10.0

4） 牛奶

（1）  对于无脂牛奶，用35%甲醇/样品提取液进行5倍稀释即可（如200µL牛奶+800µL35%甲醇/  样品提取液），每孔取50µL稀释样品进行检测；

（2） 对于含脂牛奶，4000g离心5分钟以去除上层脂肪层，再以35%甲醇/样品提取液进行5倍稀释即可（如200µL牛奶+800µL35%甲醇/样品提取液），每孔取50µL稀释样品进行检测。

稀释倍数：5.0

奶粉

（1） 称量1g奶样品中加入5mL双蒸水，涡旋2分钟；

（2） 室温（22.5±2.5）°C下4000g离心5分钟；

（3） 移取0.5mL上清液，再以2.0mL 35%甲醇/1X样品提取液进行稀释，混合均匀；

（4）  每孔取50µL用于检测

5） 血清

（1） 取0.5mL在4000g离心5分钟；

（2） 取0.2mL上清液，加入0.8mL35%甲醇/样品提取液；

（3） 每孔取50µL用于检测。

稀释倍数：5.0

6） 尿样

（1）   取0.5mL在4000g离心5分钟；

（2）   取0.2mL上清液，加入0.8mL35%甲醇/样品提取液；

（3）   每孔取50µL用于检测

稀释倍数：5.0

7） 蜂蜜

（1）  称取1g蜂蜜样品，加入19ml的35%甲醇/样品提取液混匀

（2）  每孔取50µL用于检测。

稀释倍数：20.0

10．检测步骤

以下为计算份量的表格，用户可根据自己的需要来确定需要配置多少试剂。

（1） 加入50mL的标准液或样品于所设定的孔中；

（2） 在每孔中加入100mL一抗，轻轻摇动微孔板混匀；

（3） 室温（22.5±2.5）°C避光孵育30分钟；

（4） 洗板3次，每次加入250mL 1×洗液，*后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干；

（5） 每孔加入150mL 1×二抗（避免阳光直射和工作台温度过低，孵育时适当覆盖）；

（6） 室温（22.5±2.5）°C避光孵育30分钟；

（7） 洗板3次，每次加入250mL1×洗液，*后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干；

（8） 加入100mL的TMB底物（底物本身无色，出现颜色变化不能使用）；

（9） 加入底物后立即计时，轻敲试剂盒使混匀；

（10） 在室温（22.5±2.5）°C下避光培养10~15分钟，加入100mL的终止液终止反应，在450nm下读OD值（读数前，若微孔底部有水分和指模要用无绒布擦拭干净）。

11．结果计算

（1） 分别计算标准、质控和样品的平均吸光度值和相对吸光度值。

相对吸光度值 (%) = (标准或样品吸光度值/零标准吸光度值) ´ 100 

（2） 以相对吸光度值为纵坐标，标准浓度为横坐标建立标准曲线。

（3） 从标准曲线上读取质控和样品的浓度值。

（4） 样品检测下限和定量下限计算方法如下：

样品检测下限 = (0.1ng/g) ´ (稀释倍数)

样品定量下限 = (0.25ng/g) ´ (稀释倍数)

   备注：如结果呈阳性反应，应该用其他检验方法（如色谱/质谱方法等）进行确证。

以下曲线图是氟喹诺酮类酶联免疫反应测试盒典型标准曲线