单细胞单分子CAR基因拷贝数的定量

CAR-T细胞疗法（Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy）是一种体外转化人源T细胞使之成为靶向治疗癌症的新型免疫疗法。自诺华的Kymriah和Gilead的Yescarta成功获批以来，CAR-T已成为*具前景的肿瘤疗法，不但很多难治的血液肿瘤可以得到很好的治疗，很多固体瘤的CAR-T治疗也在临床前研究阶段取得突破性的进展。

然而作为一项还在不断进化中的癌症治疗技术，其复杂难控的生产流程和早期的巨大研发投入等诸多因素使得这种癌症治疗依然非常昂贵，一个疗程动辄几百万人民币。即便如此的细胞治疗技术也会产生诸如细胞因子释放综合征（Cytokine ReleaseSyndrome）这样的副作用，这些都为上游CAR-T细胞的生产和病人回输以后的预后监控带来新的技术挑战。如何能够保证不同批次生产的CAR-T细胞质量一致，如何获知病人体内是否长期携带输入的癌症靶向性CAR-T细胞都是整个细胞治疗行业值得深挖和解决的问题。

为了这个问题，德国国家肿瘤中心主任Dirk Jäger教授的实验室开始尝试用德国图维生物科技有限公司（PixelBiotech GmbH）的新型单分子技术HuluFISH来测试CAR基因在单细胞水平上的表达情况。经过PixelBiotech公司的探针设计，基于CAR基因胞外scFV序列的探针文库被用于单个CAR基因mRNA分子的检测。初步实验（图1）表明HuluFISH CAR探针可以准确地检测到人源T细胞中CAR基因的单分子表达水平，结果显示出即使来自世界一流CAR-T实验室生产的细胞也存在着极大的表达异质性，而该异质性恰恰是影响CAR-T细胞批次差异的关键指标，是其他传统技术如qPCR所不能反映的指标。

图1. 基于HuluFISH的CAR单分子mRNA检测。染色基于人源CAR-T细胞，每个黄色圆点代表一个CAR mRNA分子，蓝色背景为细胞核染色，黄色箭头所指为单个CAR基因mRNA分子的示例。

该实验室CAR-T项目组负责人Patrick Schmidt博士也对此次尝试提出了自己的看法和期待：

“To test ａnd define a new successful CAR product it is very important to monitor it’s persistence in the body. We are currently evaluating ａnd developing PixelBiotech’s HuluFISH method in our pre-clinical research. It promises not only a CAR detection requiring very low amount of body liquid (blood, liquor, lymph) but also for the first time ever a molecular quantification in a single CAR positive cell. This novel method will therefore give us the opportunity to investigate our cellular treatments more specifically ａnd more sensitive. We are hopeful that HuluFISH will become a standard detection method for CARs at the patient bed-side.”

“为了测试和确定CAR-T细胞产品是否成功，能够检测其在体内长期存在的情况非常关键。我们目前正在临床前研究中验证和开发基于PixelBiotech公司的HuluFISH方法。该方法不仅可以通过极微量的样本（血液，脑脊液，淋巴液）就可以检测CAR，而且可以次让我们在单个CAR阳性细胞中进行分子定量。这种新型方法可以让我们更加特异、灵敏地研究我们各种新型的细胞治疗。我们希望HuluFISH能够成为临床病人CAR检测的一种标准方法。”

进一步的图像分析是通过PixelBiotech公司的HuluREAD软件来实现的全自动人工智能图像分析，结果显示了很小的单分子定量实验批间差异（图2），单个人源T细胞的CAR表达量从2个mRNA到72个mRNA分子广泛分布，平均表达量是每个人源T细胞27.5个mRNA分子。

图2. CAR基因单分子定量分析。三次独立实验的定量结果分别用三个violin plot显示。不同散点来自不同T细胞的CAR基因单分子绝对表达量。

图3. 同批次CART细胞的FACS定量结果。转染后第12天（d12）的阳性率达93.6%。

通过和同一批次的CART细胞蛋白质定量结果对比（FACS定量结果如图3），HuluFISH的单分子测量表现出很好的重现性。单分子CAR基因mRNA绝对定量的结果很好地解释了FACS结果中的荧光强度范围大不仅仅是检测器的波动，更多地来自于CAR基因本身的表达异质性。

本次实验是在德国图维生物科技有限公司（PixelBiotech），德国国家肿瘤中心，北京义妙神州医疗科技有限公司和北京同立海源生物科技有限公司共同设计合作进行的。数据版权所有者为德国图维生物科技有限公司。北京同立海源生物科技有限公司为德国图维生物科技有限公司（PixelBiotech）中国授权代理商，如有技术问题请与公司联系。

德国图维生物科技有限公司

德国图维生物科技公司（www.pixelbiotech.com）致力于提供的单分子生物标志物定量解决方案，用于癌症早期和精准诊断，病源微生物、病毒快速诊断，单细胞基因组学数据垂直验证，疫苗和食品安全质控等领域。公司目前产品有全球基于酶学方法合成的多色荧光标记探针文库技术HuluFISH，基于人工智能的全自动生物标志物三维图像分析方法HuluREAD，以及为工业客户定制推出的HuluFISH检测深度定制开发服务HuluLAB。 

德国国家肿瘤中心

德国国家肿瘤中心致力于提供一流的癌症治疗。该中心的目标是为所有复发的癌症病人提供各种临床I期的实验性治疗。各种实验性治疗中，细胞免疫疗法包括CAR-T细胞治疗是重要的研究治疗方向。德国国家肿瘤中心科研成果已经得到了广泛的临床和科研认可。德国国家肿瘤中心的科学家在过去的10年内获得了两次诺贝尔奖。

北京义妙神州医疗科技有限公司

义妙神州具有多年癌症、免疫的基础研究和转化医学研究经验，在期刊发表多篇高水平学术论文，掌握多项CAR-T核心技术。致力于将CAR-T技术和基因细胞药物应用于恶性肿瘤治疗。已经具备并且将持续扩大世界一流的基因细胞药物研发团队，始终坚信创新的研发是公司的核心驱动力。

北京同立海源生物科技有限公司