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大鼠活性氧簇（ROS）ELISA检测试剂盒产品使用说明
点击次数：165 发布时间：2016/4/15 9:06:54
试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被活性氧簇（ROS）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成*终的黄色。颜色的深浅和样品中的活性氧簇（ROS）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。
样品收集、处理及保存方法
1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心30 分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心10 分钟取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品
1. 酶标仪（450nm）
2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3. 37℃恒温箱
操作注意事项
1. 试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20 分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。
2. 实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
3. 严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。4. 所有液体组分使用前充分摇匀。
试剂盒组成
名称96孔配置48孔配置备注
微孔酶标板12 孔×8 条12 孔×4 条无
标准品（480 U/ml） 0.5mL 0.5mL 无
标准品稀释液6mL 3mL 无
样本稀释液6mL 3mL 无
检测抗体-HRP 10mL 5mL 无
20×洗涤缓冲液25mL 15mL 按说明书进行稀释
底物A 6mL 3mL 无
底物B 6mL 3mL 无
终止液6mL 3mL 无
封板膜2 张2 张无
说明书1 份1 份无
自封袋1 个1 个无
注：标准品用标准品稀释液倍比稀释为：480、240、120、60、30、15 U/ml
试剂的准备
20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20 稀释，即1 份的20×洗涤缓
冲液加19 份的蒸馏水。
洗板方法
1. 手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1min 后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5 次。
2. 自动洗板机：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5 次。
操作步骤
1. 从室温平衡20min 后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2. 设置标准品孔和样本孔。标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；待测样本孔先加样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。
3. 除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
4. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5 次（也可用洗板机洗板）。
5. 每孔加入底物A、B 各50μL，37℃避光孵育15min。
6. 每孔加入终止液50μL，15min 内，在450nm 波长处测定各孔的OD 值。结果判断
绘制标准曲线：在Excel 工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD 值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。
原创作者：上海抚生实业有限公司
