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IPTG诱导蛋白表达步骤说明
点击次数：161 发布时间：2016/4/29 9:15:19
异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。
材料
1、诱导表达材料
（ 1 ） LB （Luria—Bertani））培养基酵母膏 （Yeast extract） 5g 蛋白胨 （Peptone） 10g
NaCl 10g 琼脂 （Agar） 1-2%
蒸馏水 （Distilled water） 1000ml pH 7.0
适用范围：大肠杆菌
（ 2 ） IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃ 保存。
（ 3 ） l× 凝胶电泳加样缓冲液：
50 mmol / L Tris -CI （ pH 6 . 8 ）
50 mmol / L DTT
2 % SDS （电泳级）
0.1 ％ 溴酚蓝
10 ％ 甘油
2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料
1 ）酶溶法
（1）裂解缓冲液：
50 mmol / L Tris-CI （ pH 8 . 0 ）
1 mmol / L EDTA
100 mmol / LNaCI
（2）50 mmol / L （PMSF ）。
（3）10 mg / mL 溶菌酶。
（4）脱氧胆酸。
（5）1 mg / mL DNase I。2 ）超声破碎法
（ 1 ） TE 缓冲液。
（ 2 ） 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：
100 mmol / L Tris-HCI （ pH 8 . 0 ）
100 mmol / L DTT
4 %SDS
0.2 ％ 溴酚蓝
20 ％ 甘油
实验方案
1、外源基因的诱导表达
（ 1 ）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。
（ 2 ）按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到相应的宿主菌。
（ 3 ）筛选出含重组子的转化菌落，提取质粒DNA 作限制性内切核酸酶图谱，DNA 序列测定确定无误后进行下一步。
（ 4 ）如果表达载体的原核启动子为PL 启动子，则在30 -32 ℃ 培养数小时，使培养液的OD600达0.4-0.6 ，迅速使温度升至42 ℃ 继续培养3 -5h ；如果表达载体的原核启动子为tac 等，则37 ℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG 至终浓度为1 mmol / L。继续培养3 -5h 。
（ 5 ）取上述培养液1 mL , 1000g 离心，1 min ，沉淀，加100 μL 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后，作SDS -PAGE 检测。
2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化
1 ）细菌的裂解
常用方法有：① 高温珠磨法；② 高压匀浆；③ 超声破碎法；④ 酶溶法；⑤ 化学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方法① 、② 已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。
（1）酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；壳多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。
主要步骤为：
① 4 ℃ ，5000rpm 离心，15 min ，收集诱导表达的细菌培养液（100 mL ）。弃上清，约每克湿菌加3 mL 裂解缓冲液，悬浮沉淀。
注意事项：培养噬菌体时，Top agar中的添加量为：25 μl/3 ml（24 mg/ml）。含有IPTG的培养基4℃避光保存，须在1~2 周内使用。
保存：IPTG要2-8°C冷藏保存，配制好后保存于-20°C，室温可放置一个月。远离热源及氧化剂
原创作者：上海抚生实业有限公司
