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引物延伸实验的优化应用
点击次数：336 发布时间：2017/3/8 14:33:47
引物延伸实验的优化应用：
1.每次反应所用RNA的量。
每次反应所用RNA和引物的量取决于分析的RNA的种类（总RNA或poly(A) + RNA），目的RNA的相对丰度。如用总RNA，起始量为10ug，但分析稀有信号，每次反应用100 ugRNA。poly(A)+RNA每次反应用0.1-1.0 ug，具体决定于总RNA中poly(A)+RNA的富含量，需分析的特异RNA的浓度。在引物延伸分析前需检查目的RNA的完整。通过凝胶分析总RNA，应有完整的18S和28S核糖体RNA带。在引物延伸反应中用Northern印迹和RT-PCR分析来确定特定RNA的存在。
2.杂交温度。
2.杂交温度。
引物延伸实验中所用的杂交温度是*关键的需优化的因素。一般而言，紧密度，或引物和互补序列完全杂交所需的*适条件是，低于引物溶解温度的5oC。低于紧密度的温度可极大地增加杂交速度。应在不同的紧密度的杂交温度下作杂交，以控制引物和特异RNA的杂交。增加杂交紧密度时，带来的延伸产物的丢失表明，引物和相关的却不是等同的转录产物杂交。在碱和双价阴离子的存在下，RNA在较高温度会降解，应用甲酰胺杂交操作方案，这可有效降低溶解温度，因此可使杂交在较低的温度进行。可在杂交步骤中用以下的溶液：40mMPIPES、1mMEDTA、0.4mM NaCl、80%的甲酰胺。如用这个杂交溶液，延伸步骤前甲酰胺和盐需用乙醇沉淀后除去。
3.模板RNA和引物的量。
以下讨论了所用RNA模板和引物的起始量。反转录酶对不同模板使用的效率不同。这部分是由于RNA中存在的次级结构干扰反转录酶的聚合酶活力。如产生短的产物，这通常不是一个问题。如用AMV反转录酶，延伸温度可达55℃。
CAS134-32-71- 萘胺5g
CAS134-31-68- 羟基喹啉硫酸盐5g
CAS13408-09-8β- 甘油磷酸二钠盐10g
CAS133-32-4吲哚 -3- 丁酸1g
CAS13292-46-1利福平250mg
CAS132-32-13- 氨基 -9- 乙基咔唑5g
CAS1320-06-5油红 O5g
CAS131602-53-4淀粉样 β- 蛋白片段 25-35250μg
CAS13114-27-7玉米素5mg
CAS1303-96-4四硼酸钠，十水100g
CAS130-22-3茜素红 S25g
CAS127-07-1羟基脲1g
CAS12650-88-3溶菌酶1g
CAS12609-80-2DEAE 葡聚糖凝胶 A-2525g
CAS124-20-9亚精胺 ( 精脒 )1g
CAS1239-45-8溴化乙锭 (EB)100mg
原创作者：上海抚生实业有限公司
