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小鼠前列环素(PGI2)检测试剂盒说明
该试剂盒以 HRP 标记的链霉亲和素复合物(HRP Streptavidin Conjugate,HRP-SA)为基础,可用于检测血液,细胞、组织内的特异性 CD40 抗原。该试剂盒具有灵敏度高、特异性强、定性定位准确、背景清晰。在所用的 CD40 一抗与相应靶抗原结合后,用生物化二抗与一抗特异性结合,*后加入 HRP-SA,形成抗原—特异一抗—生物素化二抗—HRP-SA 复合物,显微镜下观察成像。
小鼠前列环素(PGI2)检测试剂盒所含试剂:
试剂 A 通透液:0.1% Triton-X 10010 mL(选用)
试剂 B 封闭缓冲液(封闭用) 20 mL
试剂 C (原装进口分装)已稀释的即用型 CD40 一抗(2.5ml)
试剂 D (原装进口分装)生物素化羊抗兔 IgG 1 支
(浓度 1.5 mg/mL,稀释比为 1:300~1:500)50 μL+抗体稀释液 20ml 试剂 E HRP-SA 复合物 1 支(浓度 1 μM,稀释比 1:50~1:200)100 μL 试剂 F DAB 显色液 5ml
用户自备试剂:
1.10mM TBS(pH7.2~7.4)三羟基氨基甲烷 1.21g氯化钠 7.6g加蒸馏水 800mL,浓盐酸调 pH 值至 7.2~7.4,*后定容至 1000mL TBS-T:TBS+Tween 20(0.05%体积比)
2.抗原修复液(依检测抗原不同而选择不同的修复液)10mM pH6.0 柠檬酸缓冲液檬酸 0.38g
柠檬酸三钠 2.45g加蒸馏水 900mL,浓盐酸调 pH 值至 6.0,*后定容至 1000mL或:0.5M EDTA 修复液(pH8.0) EDTA·2H2O 186.1g加蒸馏水 700mL,用 10mM NaOH 调 pH 值至 8.0,*后定容至 1000Ml
3.缓冲甘油封固剂 10 mL
4.Tween 20 5 mL
石蜡包埋组织切片免疫染色实验步骤(建议方案 ):
石蜡包埋组织切片 3~4μm 厚度
1.烤片: 将待做切片置于切片架上,于 60℃恒温烤箱中至少烤 1 hr;
2.脱蜡:切片放入盛有二甲苯的容器中脱蜡 3 次(即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),每次10 min;
3.水化:切片经下行酒精水化,无水乙醇 5min,95%乙醇 2 次(每次 2min),85%乙醇 2 min;75%乙醇 2min,自来水冲洗,ddH2O 洗 2×2min;
4.抗原修复:根据抗体说明书推荐方法进行抗原修复,常采用高压、微波(温度达到 98~100℃)或酶消化修复法,室温自然冷却,自来水冲洗,ddH2O 洗 2× 2min,TBS 洗涤(2×2min)(具体修复方法见附 1)* 注:有些抗原勿需修复,直接进入第 5 步封闭。
5.封闭:滴加试剂 B,37℃湿盒孵育 30 min;
6.加一抗:滴加用试剂 C(即用型一抗),37℃湿盒孵育 2 hr 或 4℃过夜;
7.洗涤:TBS-T 洗涤(3×5 min);
8.封闭:滴加试剂 B,37℃湿盒孵育 10 min;
9.加二抗:滴加用抗体稀释液稀释的生物素化二抗(试剂 D),37℃湿盒中孵育30 min;
10.洗涤:TBS-T 洗涤(3×5 min);
11.封闭:滴加试剂 Tween 20,37℃湿盒孵育封闭 20 min;
12.加 HRP-SA: 滴加用试剂 C 稀释的试剂 E(1:50~200,终浓度 5~20 nM),37℃湿盒中孵育 30 min;
13.洗涤:TBS-T 洗涤(3×5 min),TBS 洗涤(2×5 min);
14.显色:应用 DAB 溶液(试剂 F)显色;
15.复染:自来水充分冲洗,复染,脱水,透明;
16.封片:待组织标本干后,用试剂缓冲甘油封固剂封片;
17.观察成像: 显微镜下观察成像。
原—特异一抗—生物素化二抗—HRP-SA 复合物,显微镜下观察成像。
小鼠前列环素(PGI2)检测试剂盒注意事项:
1.修复后缓冲液须自然冷却,自来水冲洗后方能把切片取出,骤冷有可能导致结晶或抗原封闭。
2.缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到,用过的柠檬酸缓冲液不能反复使用。
3.若试剂为微量浓缩液,用前应低速离心,将内盖和管壁附着的溶液离到底部。
4.封片前一定要换用 TBS 充分洗涤,以便洗去组织上残留的 Tween 20,否则会影响结果观察。
5.如须复染细胞核,则在封片前复染或直接采用含有染核试剂的封片剂进行封片。
附 1: 抗原修复方法
常用抗原修复液:柠檬酸缓冲液(0.01M pH6.0)、EDTA 抗原修复液(pH8.0 或9.0)等等。
一、酶消化修复法酶消化修复切片脱蜡水化处理,TBS 冲洗,在组织上滴加胃蛋白酶或胰蛋白酶,37℃孵育20~30min 后 TBS 冲洗即可。
二、微波抗原修复法
微波盒中加入抗原修复液微波加热至沸腾,将脱蜡水化后的切片置于耐高温塑料切片架上,放入已沸腾的缓冲液中,中档或高档继续微波 10~15min,取出微波盒冷却至室温后,自来水冲洗,取出切片。因不同微波炉微波处理时间存在差异,须自行调整。
三、直接高压抗原修复法
取修复液于不锈钢高压锅中加热至沸腾,将组织切片置于耐高温切片架上,修复液沸腾后放入切片架,盖上锅盖,待喷气后计时 1.5~2.5min 即可脱离热源,自然冷却至室温后自来水冲洗,取出切片。此方法适用于较难检测或核抗原的修复。四、隔水式高压抗原修复法不锈钢高压锅中加自来水加热至沸腾,微波盒中加入修复液于微波炉中加热至沸腾,将切片放入微波盒中,再将微波盒放入高压锅中盖上锅盖,待喷气后计时 4~8 min 即可关闭热源,自然冷却至室温后自来水冲洗,取出切片。此方法适用于较难检测或核抗原的修复。
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