一、ELISPOT质量控制简介

      那么如何能控制ELISPOT检测的质量呢？如果有一种细胞和一种刺激物，并且ELISPOT斑点频率是已知的话，那么就有了一个ELISPOT的标准系统。每次其它样品检测时，只要带上这个系统，实验者就可以用标准系统来质控待测样品的ELISPOT检测。这也是所有其它检测质控的基本原理。

      现在的关键是找到这样一种细胞和一种刺激物，每次都能做出完全相同的ELISPOT结果。

二、标准细胞必须采用冻存细胞库

     首要问题是细胞。我们知道，细胞是有生命的，不像无生命的物质那样容易保存。那么能不能采用新鲜细胞呢，比如每次都从同一个志愿者身上采集？不能。因为志愿者的健康状态和免疫状态都是动态的，虽说采自同一个人，但是细胞免疫水平可能会有变化，ELISPOT结果无法完全重复。那么能不能采集细胞之后长期饲养呢？不能。且不说长期培养成本高且周期长，细胞本身的免疫水平和克隆数目都会随着培养和传代而发生变化。

      能满足ELISPOT检测长期不变化的只能是冻存细胞库。一次采集大量细胞冻存在-197°C的液氮环境中，细胞的斑点频率可以在数年之内恒定不变。PBMC分离和冻存复苏的方法参见本网站内容。

三、标准刺激物选用CEF或者ICE

     那么，刺激物选择什么呢？非特异性的刺激物很便宜，但是不能用于质控。三个原因阻碍了这一点。

    其一、非特异性的刺激物刺激效果不稳定。如图9.2所示，非特异性的刺激物（有丝分裂原Mitogen）的刺激曲线几乎没有平坦的部分。也就是说，刺激物的浓度有细微变化，马上就会体现在刺激斑点数目的变化上了，这样实验结果很难完全重现。相反，抗原的刺激曲线非常平坦，只要达到有效刺激浓度，斑点频率就不再变化。

     其二，非特异性刺激物的刺激原理与特异性的刺激物刺激原理不同。一般来说，质控系统和被质控的体系之间越相近越好：经过相同的处理，接受相同的影响因素，发生相同的物理、化学、生物过程。但是非特异性刺激物刺激是单细胞过程，与抗原经APC呈递而刺激T细胞是完全不同的过程。所以用非特异性刺激反应质控与特异性刺激反应质控，从原理上也说不同。

     其三，非特异性刺激物多数是蛋白质，比如PHA与ConA，效价不稳定，容易失活，不易保存。相对而言，作为抗原的蛋白和多肽，免疫原性和刺激效果要稳定得多。

      综上所述，在质控系统中，标准刺激物宜选用抗原。抗原中，以T细胞表位肽组成*简单，机理*清楚，结果*稳定，所以是。再则考虑到标准刺激物对健康人的T细胞也应该能刺激作用，所以上选定三种常见病毒CMV、EBV、Flu Viurs，把它们的32条T细胞表位肽集中起来，作为ELISPOT标准样性刺激物CEF。另有简化版的23条肽肽库ICE（货号CT370），更加实用。 

 四、实验室内部质控与实验室之间的质控以及国家质控体系

      以上介绍了ELISPOT质控系统的原理与组成。现在来介绍一下质控系统的应用范围。根据质控系统的应用范围，可以分为以下三个层次。

     *基本的层次是实验室内部质控系统。比如一个实验室有好几组实验人员，会在很长的时间内（一年或数年）做高质量的ELISPOT检测。这就需要用到实验室内部的质控系统。因为实验室内部的条件相对稳定，管理相对统一，实验室内部质控系统的技术目前已经非常成熟。达科为公司有整套建立实验室内部ELISPOT质控系统的方案，已经帮国内数家实验室建立了这一系统。实践也证明了该系统有效可行，指控效果非常明显。

     第二个层次是实验室之间的质控系统。当今的科研有合纵连横的趋势，一些重大的科研项目或者疫苗的临床评估往往是跨实验室、跨地域甚至跨国家的联合项目。为了使这些分布在不同地区不同时间的ELISPOT检测有相同的标准和可信度，必须采用实验室之间的质控系统。就我们达科为公司与国内十余家实验室联合作的评估而言，实验室之间的质控存在的一个非技术障碍，那就是冻存质控细胞的运输问题。

     冻存细胞能通过液氮运输，如果采用小型背负式液氮罐，实验者可以在同一城市的不同实验室之间运输冻存细胞，但是对于跨城市或者跨国家的长途运输就不太可能了。液氮罐上飞机或者火车都是非法的。如果采用干冰运输，冻存细胞的状态和存活率就会打折扣。我们的研究表明，经过干冰运输的细胞，存活率只有80%左右。并且干冰运输的可靠性也不能完全得到保证，一旦干冰耗尽或者细胞未完全被干冰包裹，细胞的存活率就会直线下降，甚至完全死亡。

     第三个层次是国家质控系统。任何成熟的检测技术都会有相应过国家标准和质控系统。但是由于ELISPOT技术还在发展中，目前世界上还没有任何一个国家建立了ELISPOT技术的国家标准和质控系统。美国是该项工作开展得比较早的国家，目前仍然在不同实验室之间作验证工作，研究建立质控系统的可行性。

    如表9.1所示，这是我们一次实验的结果。可以看到，前三个实验室的结果重复性很好，但是第四个实验室的结果明显偏小。

原创作者：上海信裕生物科技有限公司