考马斯亮蓝一定范围内与蛋白质浓度成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
简要介绍考马斯亮蓝染液的作用：
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg/mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
测蛋白用的考马斯亮蓝的配制：
称取考马氏亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）50mg，
2. 加95%乙醇25ml溶解，
3. 加85%磷酸50ml，
4. H2O定容到500ml，
5. 过滤去除少量未溶解物。
6. 4℃保存备用。
考马斯亮蓝染色液R250配方（100ml）:
考马斯亮蓝R250 0.25g
甲醇 45ml
冰醋酸 10ml
ddH2O 45ml
考马斯亮蓝脱色液配方：
甲醇 250ml
冰醋酸 80ml
ddH2O定容至1000ml。
具体操作步骤：
1.电泳结束后，切取少量含有MARK蛋白以及少许样品的小部分凝胶进行染色，其余部分用保鲜膜包好，放在4℃冰箱保存。
取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶。置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温染色1小时或更长时间。
注：具体的染色时间取决于凝胶的厚度和染色时的温度。凝胶较厚，温度较低，则染色时间宜适当延长。凝胶较薄，温度较高，则染色时间可以适当缩短。通常染色至凝胶的颜色和染色液的颜色非常接近，在染色液中几乎看不清凝胶时，可以认为已染色充分。染色2-4个小时或更长时间不会对*终的染色效果产生负面影响。
2 倒出染色液。染色液可以回收重复使用至少2-3次。
3 加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动，室温脱色4-24小时。期间更换脱色液2-4次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期。通常蛋白条带在脱色1-2小时后即可出现。
注：脱色期间可以在脱色液中加入一片吸水纸，可以使部分染料吸附在吸水纸上，加快脱色。脱色时间过长也会导致蛋白条带的颜色变浅。
4 完成脱色后，用ddH2O浸泡，至于未染色凝胶长度相等时，参照MARK蛋白，与未染色凝胶对比，切下所需蛋白成分的凝胶，收集起来。然后把所要提纯的蛋白从凝胶中分离出来。
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程：
该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸或溶菌酶。去污剂的浓度超过0．2%影响测定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。
1．Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至1000ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。
2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。
3．将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(用PBS)。
4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。
5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min．
6．根据标准曲线计算待测样本的浓度。

原创作者：上海信裕生物科技有限公司