当前位置:易推广>上海信裕生物科技有限公司>技术文章>PCR引物合成技巧
企业档案
会员类型:会员
已获得易推广信誉 等级评定
(0 -40)基础信誉积累,可浏览访问
(41-90)良好信誉积累,可接洽商谈
(91+ )优质信誉积累,可持续信赖
易推广会员:9年
最后认证时间:
注册号: 【已认证】
法人代表: 【已认证】
企业类型:经销商 【已认证】
注册资金:人民币50万 【已认证】
产品数:27194
参观次数:13553287
手机网站:http://m.yituig.com/c115321/
旗舰版地址:http://www.xybio-sh.com
检测试剂盒
- 牛Elisa试剂盒
- 马Elisa试剂盒
- 猴Elisa试剂盒
- 鸡Elisa试剂盒
- 猪Elisa试剂盒
- 兔Elisa试剂盒
- 其他Elisa试剂盒
- 大鼠Elisa试剂盒
- 小鼠Elisa试剂盒
- 人Elisa试剂盒
- 犬检测试剂盒/Dog
- 其它检测试剂盒/General
- 猴检测试剂盒/Monkey
- 鸡检测试剂盒/Chicken
- 马检测试剂盒/Equine
- 牛检测试剂盒/Bovine
- 山羊检测试剂盒/Goat
- 兔检测试剂盒/Rabbit
- 豚鼠检测试剂盒/Guinea pig
- 小鼠检测试剂盒/Mouse
- 猪检测试剂盒/Porcine
- 大鼠检测试剂盒/Rat
- 人检测试剂盒/Human
抗体
蛋白/多肽/抗原
原代细胞
细胞系
分子生物学
生化试剂
标准品/对照品
技术文章
PCR引物合成技巧
点击次数:3308 发布时间:2017/6/22 14:59:48
目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产,无论采用什么机器合成,合成的原理都相同,主要差别在于合成产率的高低,试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。申能博彩公司采用的合成仪主要机型为ABI3900高通量合成仪,合成长链主要采用Beckman 1000M和PE8909 DNA合成仪,引物修饰和高OD数合成采用ABI394等。
亚磷酰胺三酯法合成DN段,具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的,合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的,相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。
步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应,脱去其5'-羟基的保护基团DMT,获得游离的5'-羟基;
第二步,合成DNA的原料,亚磷酰胺保护核苷酸单体,与活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,它的3'端被活化,5'-羟基仍然被DMT保护,与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。
第三步,带帽(capping)反应,缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%),用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应,这种短片段可以在纯化时分离掉。
第四步,在氧化剂碘的作用下,亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤,直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。
通过氨水高温处理,连接在CPG上的引物被切下来,通过OPC, PAGE等手段纯化引物,成品引物用C18浓缩,脱盐,沉淀。沉淀后的引物用水悬浮,测定OD260定量,根据定单要求分装。
2.引物纯化方式有哪些,如何选择?
◆ C18柱脱盐:有人称其为简易反相柱,它对DNA有特异性的吸附,可以被有机溶解洗脱,但不会被水洗脱,所以能有效地去除盐分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上,它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。
◆ OPC纯化: OPC纯化是根据DNA保护基(DMTr基)和Cartridge柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DN段。OPC法纯化的DNA纯度大于95%。适用于40mer以下引物的纯化。
◆ PAGE纯:PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对DN段进行分离,然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法,纯化后的DNA纯度大于95%,对长链Oligo DNA (大于50mer)的纯化特别有效。
◆ HPLC纯化:HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理,对DN段进行纯化。纯度可以大于99%。主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的弱点是成本较高,批量生产效率不高。
3.引物的OD数如何定量?
答:引物合成引物OD数是这样测定的:用紫外分光光度计,波长260nm,石英比色杯,光程为1厘米,测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度稀释到0.2-1.0之间。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后,用1ml水稀释测OD值。需要根据稀释倍数换算出母液的OD值。
原创作者:上海信裕生物科技有限公司