已冻存细胞的传代培养

实验试剂

细胞培养液成分为RPMI1640基本培养液 10%胎牛血清 1%三抗，PBS，冻存培养液(含10%DMSO或甘油)，Trypsine-EDTA消化液，液氮

实验设备

水浴锅，35mm培养皿，37℃培养箱，无菌冻存管，低温冰箱，超低温冰箱

实验材料

已冻存的HEK293和HeLa细胞

实验步骤

1. 细胞的复苏

    1) 保存细胞的冷冻管直接投入37℃温水，不时摇动令其尽快融化，解冻1分钟；

    2) 取出冷冻管，用酒精消毒后打开管盖，吸出细胞悬液，注入离心管并滴加10倍以上培养液，混合后低速离心，除去上清液，再用培养液重复洗一次；

    3) 用培养液适当稀释后，接种35mm培养皿中，反复吹打混匀后，放在37℃的培养箱静置培养，次日更换培养液，继续培养。

2. 细胞的传代(贴壁细胞的消化法)

    1) 吸出皿内旧的培养基，加PBS于皿中，清洗两次，用于洗去瓶内残存的血清，以防止血清对胰蛋白酶活性的影响；

    2) 加0.2ml Trypsine-EDTA消化液轻轻摇动，使消化液流遍所有细胞表面充分消化细胞，发现胞质回缩、细胞间隙增大后，立刻终止消化；

    3) 吸出消化液，再加培养液，反复吹打至没有细胞团。吹打动作要轻柔，尽可能不要出现泡沫，这些都会对细胞有损伤。将细胞悬液接种到新的培养皿中。

3. 细胞的冻存

    1) 从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，是对数生长期细胞，已经长满的细胞冻存后生存率低。冻存前一天换一次培养液；

    2) 用Trypsin-EDTA把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则不需处理。依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管并计数离心；

    3) 去除Trypsin-EDTA，加入配制好的冻存培养液(含10%DMSO或甘油)，冻存液中细胞的*终密度为10⁶/ml-10⁷/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管，每个冻存管加液1-1.5ml。冻存管上标明细胞的名称；

    4) 把冻存管放入4℃冰箱30min；然后转移至-20℃2h；随后将冻存管转移到-80℃过夜；第二天迅速浸入液氮中长期保存。要适当掌握降温速度，过快会影响细胞内水分的渗出，太慢则促进冰晶的形成。