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规格：30次

我准备按照你提供的基本程序尝试一次。免RNA提取FFPE RT-PCR试剂盒还需要问的问题是：

1.洗涤包含体，实际上就是洗涤细胞裂解液离心后的沉淀，对吗？我将沉淀-20度保存，应该没有什么影响吧？另外，我看到有的包含体洗涤液配方中含有PMSF，是蛋白酶抑制剂，它是否对目的蛋白有影响呢？

2.尿素洗涤包含体，洗涤上清和沉淀分别进行SDS-PAGE，得到一个收率和纯度*佳的尿素浓度。免RNA提取FFPE RT-PCR试剂盒洗涤上清和沉淀是指用尿素洗涤细胞裂解沉淀的吗？但不溶的沉淀能跑SDS-PAGE吗？这个收率和纯度是指洗涤后溶液里面浸出的目的蛋白吗？

3.我表达的目的蛋白是分解底物释放无机磷酸盐的一种水解酶，不适合用含有磷酸盐的PBS溶液来洗涤和缓冲，而是用Tris-HCl来洗涤和缓冲的。那我用Tris-HCl来配8M尿素，对复性有影响吗？

不知道你能否提供相应的参考文献或者书目给我，我再仔细看看。

免RNA提取FFPE RT-PCR试剂盒技术回答：

1）包含体在-20度或-70度保存较好，包含体状态的蛋白稳定性好，一但复性成功，溶液状态的蛋白容易被降解。PMSF，是蛋白酶抑制剂，应该对目的蛋白影响不大。我原来做实验时一般不加PMSF，加与不加看你的蛋白的稳定性。

2）洗涤上清和沉淀是指用尿素洗涤细胞裂解产物离心后的沉淀，用tip挑一点沉淀后用1倍的loading buffer重悬，与其他样品一起煮后电泳。从洗涤上清和沉淀的电泳情况可以看出目的蛋白的损失情况和杂蛋白的去除情况，免RNA提取FFPE RT-PCR试剂盒选择一个合适的洗涤条件有时对纯化和得率很重要。

3）用Tris配尿素，OK! 

 91108B-50 T3体外转录试剂盒 50次

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第六章 “克必隆”克隆及表达系列

片段处理

60105-50 加A试剂盒 50次

60106-50 加T试剂盒 50次

60107-20 DNA粘转平试剂盒 20次

载体及感受态细胞

Feb-10克必隆G载体 2ug

51104-2 克必隆B载体 2ug

100944-2 克必隆U6载体 2ug

60803A  可保种型蓝白T载体 50ng

60803B  可保种型蓝白T载体 50ng

60603-1 即用型蓝白T载体 1ug

90601-2 EGFP-N3质粒 2ug

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60908常用载体 2ug