T7 RNA聚合酶
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生化试剂
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详细内容
数量: 大量
保质期: 一年
保存条件: -20℃保存
规格: 1000U
本酶是噬菌体T7 DNA编码的酶,对T7启动子序列具有高度特异性,不能识别其它生物来源的启动子。本酶是依赖于DNA的RNA聚合酶,具有 5′→3′的RNA 聚合酶活性,以含有T7启动子序列的双链DNA为模板,以NTP为底物,合成与启动子下游的单链DNA互补的RNA。 1. 为 Northern杂交以及Southern杂交制作高标记探针。 2. 制作 RNA 剪接反应(RNA Splicing)的前体。3. 以帽类似物(Cap analog)为引物,制作Capped mRNA。
酵母与原核之间在重组蛋白的生产成本上的比较要看具体情况。T7 RNA聚合酶传统的酿酒酵母与大肠杆菌相比产量多数情况下处于劣势。但毕赤酵母高密发酵特性突出,表达量则常常超过大肠杆菌系统,如果实现高效分泌表达,则纯化成本非常低,具有生产成本优势。但毕赤酵母的胞内表达在纯化方面则不一定有优势。
T7 RNA聚合酶除了用于规模化生产重组蛋白之外,毕赤酵母还在基础研究方面发挥着重要 作用,比如表达蛋白用于结构分析,信号传导途径研究,当然也包括酶学研究。用酵母或原核系统对于活性未知的酶进行研究的例子少,一般酶活鉴定往往是用天然的蛋白解决的。
如果需要,完全可以利用毕赤酵母进行酶活性的探索,从以往的战绩来看,毕赤酵母表达表达成功的例子实在是太多了,T7 RNA聚合酶比例也很高,虽然仍存在风险。
1)原核诱导时间,从你的结果来看,诱导1-5小时变化不大,时间点影响较小,取3小时没有问题。很多情况下,温度对可溶性影响较大,不知道你30度诱导的可溶性如何?如果蛋白主要是可溶性的,那进一步降低诱导温度的意义也就小了。如果仍有较多的包含体,T7 RNA聚合酶倒是可以再降低一下诱导温度。此外,很多蛋白包含体复性后有活性,如果可溶性表达困难或表达量太低,仍可以考虑包含体复性策略。
2)酵母细胞的破壁可以采用机械法,也可以采用酶法。机械法主要是高压匀质和珠磨,主要用于中试和生产,但有的仪器也可以兼顾实验室规模,这两种方法效率较高。酶法主要用于制备球形体,是一种外源基因高效转化的方法,T7 RNA聚合酶但用于破壁检测表达则成本太高,此外使用酶破壁也会引入杂蛋白。我查过一篇文献,是小量裂截用于表达检测的,我没有直接作过,但我们实验室的研究生反映还可以。
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