反应原理

喹诺酮类（Quinolones，QNS）酶联免疫检测试剂盒，主要是利用抗原与抗体的特异性免疫化学反应的基本原理来进行的，换句话说，就是利用酶标记物与样品中的喹诺酮与微孔中的抗体进行竞争反应。在整个反应当中，如果样品中的喹诺酮残留的越多，相对地就会竞争反应越多的酶标记物，使得能结合上抗体的酶标记物相对地减少，用TMB底物显色，样品中的喹诺酮含量与样品的吸光度值呈反比，与标准曲线比较即可得出喹诺酮含量。

【试剂盒组份】

1、酶标板：8孔/条，12条/板

2、喹诺酮标准溶液(1.5 mL / 瓶)：0 ppb、0.3 ppb、1.1 ppb、3.3 ppb、10 ppb、30 ppb; 100ppb    

3、10倍浓缩萃取稀释液 …………………………… 50 mL

4、10倍浓缩清洗液…………………………………  50 mL

5、200倍喹诺酮酶标记物…………………………  0.1 mL

6、显色液 ………………………………………………12 mL

7、反应终止液 …………………………………………13 mL

【试剂盒技术指标】

试剂盒灵敏度：  0.3ppb

样本检测下限：

全蛋……………………………………………… 2 ppb

交叉反应率：

回收率：

【所需仪器和试剂】

所需仪器：酶标仪、离心机、均质机、微量移液器(单道20µl-200µl、100µl-1000µl、多道250µl)

所需试剂：

1、分析级甲醇：

     80%甲醇: 100%甲醇 80ml + 1×萃取稀释液20ml

70%甲醇: 100%甲醇 70ml + 1×萃取稀释液30ml

  60%甲醇: 100%甲醇 60ml + 1×萃取稀释液40ml

 55%甲醇: 100%甲醇 55ml + 1×萃取稀释液45ml

  25%甲醇: 100%甲醇 25ml + 1×萃取稀释液75ml

  8%甲醇: 100%甲醇 2ml + 1×萃取稀释液23ml

  4%甲醇: 100%甲醇 1ml + 1×萃取稀释液24ml

2、正己烷

3、分析级乙醇  

35%乙醇: 100%乙醇 35ml + 1x萃取稀释液65ml

【样本前处理】

样品处理前须知：

（1）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。

（2）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。

样品处理：

本试剂可检测生乳、鸡肉、猪肉、鱼、虾 全蛋等残留之喹诺酮类抗生素：

1、待测物为生乳，则依以下方法进行处理

n  取1 ml之待测生乳以离心机离心20分钟 (3500 rpm) ，吸取中间液体层200uL，并加入35%乙醇800uL稀释5倍。

n   样品敏感度：2 ppb

n   稀释倍数：5

2、待测物为鸡肉或猪肉或鱼类样品，分别依感度需求以下列方法择一进行：

方法一：

1.将2g已均质样品放入15 mL离心管中，再加入4mL 25%甲醇及1N NaOH 50uL，震荡混合约1分钟，以60℃隔水加热约10分钟，再以上下转动充分混合约10分钟。

2.以离心机离心15分钟 (3500 rpm) ，再吸取上层液中的底部以1×萃取稀释液再稀释1.5倍 （即上层液200 μL加1×萃取稀释液100 μL）。

n   样品敏感度：1.5ppb

n   稀释倍数：4.5

方法二：

1)         将1g已均质样品放入15 mL离心管中，再加入3 mL 80%甲醇，震荡混合约1分钟，再以上下转动充分混合约10分钟。

2)         以离心机离心15分钟（3000 rpm），取1 mL上层液（80%甲醇）至10 mL玻璃管中，于50 ℃下，利用氮气将有机溶剂吹干。

3)         于此玻璃管中加入加入0.5 mL 4%甲醇，先将残余物完全溶解后（若未能完全溶解，可能会导致回收率降低），再加入正己烷1mL，震荡混合约20~30秒钟。

4)         以离心机离心15分钟（3000 rpm），利用吸管吸去包含中间乳化层部分的上层液﹙正己烷﹚，再吸取下层液备用。

n   样品敏感度：0.45 ppb

n   稀释倍数：1.5

3. 待测物为虾，则依以下方法进行萃取：

方法一：

1)      将2g已均质样品放入15 mL离心管中，再加入4 mL 55%甲醇，震荡混合约1分钟，再以上下转动充分混合约10分钟。

2)      以离心机离心15分钟（3500 rpm），再吸取上层液中的底部以1×萃取稀释液再稀释1.5倍（即上层液200μL加原倍萃取稀释液100μL）。

n   样品敏感度：1.5 ppb

n   稀释倍数：4.5

方法二：

1)      将1g已均质样品放入15 mL离心管中，再加入3 mL 60%甲醇，震荡混合约1分钟，再以上下转动充分混合约10分钟

2)      以离心机离心15分钟（3000 rpm），取1 mL上层液﹙60%甲醇﹚至10mL玻璃管中，于50℃下，利用氮气将有机溶剂吹干。

3)      于此玻璃管中加入加入0.5mL 8%甲醇，先将残余物完全溶解后（若未能完全溶解，可能会导致回收率降低），再加入正己烷1mL，震荡混合约20~30秒钟。

4)      以离心机离心15分钟（3000 rpm），利用吸管吸去包含中间乳化层部分的上层液﹙正己烷﹚，再吸取下层液备用。

n   样品敏感度：0.45 ppb

n   稀释倍数：1.5

4、待测样品为养殖水

   取15ml养殖水于50ml离心管中，4000rmp/min离心10分钟。用离心后的养殖水上清液将10倍的样品稀释液，稀释成1倍的溶液 （9体积养殖水和1体积10倍浓缩样品稀释液），混匀待检。

n   样品敏感度：0.3 ppb

n   稀释倍数：1.1

5. 待测物为全蛋，则依以下方法进行：

1)         将1g已均质之全蛋放入15 mL离心管中，再加入3 mL 70%甲醇﹙Methanol﹚，并震荡混合﹙vortex﹚约1分钟。

2)         .以离心机离心15分钟﹙3500 rpm﹚，再吸取上层液至干净离心管中，并以1X提取液再稀释1.5倍﹙即上层液200μL加原倍提取液100μL﹚。

n  样品敏感度: 2 ppb

n  稀释倍数: 6

注：若萃取过程中乳化现象太严重，看不到下层液有澄清部分，请先将玻璃管中大部分上层液（正己烷）取出，剩余乳化部份再利用隔水加热80~100℃约3分钟后，即可大幅改善乳化现象。

【检测程序】

1、将标准品（0 ppb、0.3 ppb、1.1 ppb、3.3 ppb、10 ppb、30 ppb）对应微孔按序编号后分别分别加入100 µL喹诺酮标准溶液。

 2、在其他的微孔加入100 µL已完成前处理的样品溶液。

 3、再于每一微孔另加入50 µL已稀释的喹诺酮酶标记物（参见注意事项4）。

 4、轻敲酶标板四周，使其充分混合后于室温下避光静置50分钟。

 5、将微孔中的反应液甩掉，再将已稀释清洗液（参见注意事项3）加满每一微孔后甩掉，重复3次。

 6、*后一次甩掉清洗液后，在吸水纸上拍干。

 7、于每一微孔加入显色液100 µL后，轻敲酶标板四周，使其充分混合。

 8、于室温下避光静置20分钟。

 9、加入反应终止液，每一微孔加入100 µL。

 10、酶标仪以单波长450 nm或双波长450 nm / 650 nm读值。

【结果判定】

1、定性判定：

用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出样本所含喹诺酮类浓度范围（ng/ml）。假设样品1的吸光度值为0.313，样品2的吸光度值为1.032，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.892；0.3ppb为1.501；1.1ppb为1.175；3.3ppb为0.751； 10ppb为0.421； 30ppb为0.198。则样品1的浓度范围10ppb-30ppb；样品2的浓度范围1.1ppb-3.3ppb。（再乘以相应的稀释倍数）

2、定量判定：

所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B0—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值

以标准品百分吸光率为纵坐标，以喹诺酮标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数，然后除以相应交叉率即为样本中相应喹诺酮类的实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。

【注意事项】

1、使用前请先将试剂盒回温至室温 (置于室温20-25℃，60分钟以上)，各溶液皆摇匀后方可使用。

2、回温后，取出所需酶标板条，将剩余未测的ELISA孔条立即放回铝箔袋中，置于4 ℃保存。

3、10倍萃取稀释液与10倍清洗液请用蒸馏水稀释10倍方可使用。 (如1 mL浓缩稀释液加9 mL蒸馏水) 稀释后的原倍萃取稀释液和原倍清洗液可于4 ℃保存一周。

4、原倍喹诺酮酶标记物结合体配制：

请用原倍萃取稀释液将200倍喹诺酮酶结合物以200倍稀释即完成原倍酶标记物结合体配制。亦即采用浓缩200倍喹诺酮酶结合物0.1ml+1×萃取稀释液19.9ml比例稀释；请在进行上盘测试前方可稀释，过早稀释易造成数据偏差。

5、萃取流程请使用P.P.材质的15 mL离心管以免腐蚀。

6、反应终止液含0.5 N HCl，请小心操作。

7、本试剂盒的所有试剂出厂前均做过完整的测试，请使用试剂盒提供的药品及试剂，勿任意更换。

8、ELISA所得的喹诺酮浓度若低于该样品样品敏感度即可视为该样品背景值，无须回乘稀释倍数。反之若所得的喹诺酮浓度若高于该样品样品敏感度，即可能为喹诺酮阳性样品，建议使用再其它检测方法检测，如GC/MS等。

9、进行生乳的样品制备时，在ELISA操作时中请确实轻敲酶标板一到二分钟(D.操作步骤的第四点)。

【规    格】   96T

【贮    藏】  2～8℃，避光保存

【有 效 期】  一年 (生产日期及批号见包装盒)