概念：细胞培养又称细胞克隆技术，细胞培养是指在人工创造的与体内环境相似的条件下（比如适宜的温度、pH，以及一定的营养），使细胞生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种技术。
根据细胞种类的不同细胞培养分为原代培养和传代培养。根据细胞生长特点的不同又可分为贴壁培养和悬浮培养。
1.传代培养：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。培养细胞的“一代”，不表示细胞分裂一次，而是指培养细胞从接种到再次转移培养的过程。在一次传代培养中，细胞能倍增3-6次。
2.原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之称为原代培养。
3.贴壁培养：必须贴附于支持物表面才能生长。多为各种实体瘤细胞。
4.悬浮培养：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。多为各种造血系统肿瘤细胞。
二、细胞生长过程：
游离期；贴壁期；潜伏期；对数生长时期；停止期（平台期）
1.游离期：细胞接种后在培养基中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形（10min-5h）。
2.贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。大部分细胞株在10min－5h内贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再附着在吸附有促贴壁因子的底物上。培养瓶多涂有生长基质以帮助细胞贴附。
3.潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24h。
4.对数生长时期：细胞数随时间变化成倍增长，活力zui佳，适合进行实验研究。
5.停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。机制：接触抑制、密度依赖性。
三、实验准备：
1.细胞间仪器
1）生物安全柜（Biological safety cabinets, BSCs）：生物安全柜是一种负压的净化工作台，正确操作生物安全柜，保持无菌环境的同时能够保护工作人员、受试样品并防止交叉污染的发生。

2）培养箱（Incubator）：一般培养条件为：温度：37℃，湿度：10%，CO2浓度：5%~10%。

3）水浴锅：预热从4℃冰箱拿出的培养基，PBS等。从4℃冰箱中拿出的液体直接用于细胞，温度波动较大会对细胞的正常生长造成影响，尤其当细胞的生长状态尚不稳定或对外界刺激较敏感时（复苏、处理因素作用后等）。同时，低温可能还会干扰某些处理因素的作用，比如某些酶的作用，药物的溶解等。
4）低速离心机：收集细胞。
5）冰箱：存放培养基，药物等试剂。
6）倒置显微镜：观察细胞生长状态和生长密度。
7）移液器、电动移液器：添加培养基体积较大时，电动移液器更方便，快捷。

8）细胞冻存盒：程序性细胞冻存盒，冻存细胞遵循的是"慢冻"原则，主要是防止细胞在冻存过程中形成冰晶而对细胞造成损害。

2．常用耗材
1）细胞培养瓶：规格T25\T75\T125\T225。根据实验需求，选择不同规格的培养瓶。

2）细胞冻存管：具有耐高温和密封性好特点。分为外旋式和内扣式。

3）离心管：收集细胞，分装培养基和配溶液等。
4）移液管：配合电动移液器使用。

3. 常用试剂
1）培养基：不同细胞对培养基要求不同，根据需要选择，DMEM，PRMI是比较常用的培养基。使用之，认真阅读说明书，说明书会注明其成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。某些成分如NaHCO3、谷氨酰胺是必须添加的，根据实验需要选择。培养基需要密封无菌保存于4℃。
2）血清：常用血清有胎牛血清（FBS）、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量zui好。500mL规格的血清使用，建议分装成50mL/瓶，并保存在-20℃冰箱。
3）消化液：胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞之间以及细胞和底物的粘连，从而使细胞分离。常用的胰蛋白酶液浓度是0.25%，胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。胰蛋白酶液消化时间：细胞种类不同消化时间也不一样，一般是1-10 min。含血清的培养基可以终止胰蛋白酶对细胞的消化作用。
4）PBS：PBS是一种平衡盐溶液，适用于各种细胞培养应用，例如解离清洗细胞、稀释细胞进行计数和制备试剂。除PBS外，DPBS、HBSS、EBSS也是常用的平衡盐溶液。
5）双抗（Penicillin-Streptomycin P/S）：青链霉素混合液，用于抑制细菌生长，避免细胞污染。建议在-20℃冷冻保存，现用现配。
四、实验步骤
   刚开始培养某种细胞时，一定要查清楚关于该种细胞的详细信息，包括需要使用的培养基、血清、添加剂，通常的消化时间、传代时间等。实验，至少提30min打开操作台紫外灯和37℃水浴锅，将PBS、胰酶、培养基等试剂提10min预热。
以传代贴壁细胞为例：
1.细胞复苏

1）提配置培养基：10% FBS+1% P/S+培养基（以下称10%培养基）；

2）将细胞冻存管从液氮中取出后，立即放在37℃水浴锅中摇晃。时刻关注，冻存管内全部融化后，低速离心机常温1000r/min，离心5min（缓冻速融）；

3）离心后，立刻用移液枪吸出上层液体，再吸取1ml 10%培养基，将细胞团块重悬，轻轻吹打5~8次即可，观察液体无明显白色团块后将重悬液加入T25细胞培养瓶，再向培养瓶中补5~6ml 10%培养基，摇晃均匀，将培养瓶放在37℃，5% CO2细胞培养箱中，12、24h后观察细胞生长情况。

2. 细胞传代

1）观察细胞生长情况和生长密度，在倒置显微镜下观察，当细胞密度在80% ~90%之间，可以传代。若培养基变黄（未污染的话），但细胞密度较低，将培养基弃掉，2~3mL PBS润洗1~2次后，加入10% 培养基，继续培养，不进行传代。

2）弃去细胞瓶内培养基，加2~3mL PBS润洗细胞1~2次，用移液枪将PBS吸干净，防止影响胰酶消化。

3）加2~3mL 0.25% 胰酶消化1~10min（不同细胞贴壁程度不同，消化时间不同），主要分为湿法消化和干法消化。

4）当细胞成片脱落时，立刻加入4~6mL 10% 培养基停止消化，防止消化过度。吹打动作轻柔，吹打至3、5个细胞连成团即可（消化为主，吹打为辅）。将细胞悬液加入离心管，常温，1000rpm/min，离心3~5min（根据实际情况，这步可以省略）。

5）细胞团块用10% 培养基重悬，补10%培养基到一定体积（T25：5~6mL; T75：15mL），传代完毕。记录传代次数，传代比例一般为1：2或1：3，两次传代之间至少间隔24~48h。

3. 细胞冻存

1) 观察细胞生长情况和生长密度，在倒置显微镜下观察，当细胞密度在90%以上，进行冻存。

2) 弃去细胞瓶内培养基，加2~3mL PBS润洗细胞1~2次，用移液枪将PBS吸干净，防止影响胰酶消化。

3) 加2~3mL 0.25% 胰酶消化1~10min（不同细胞贴壁程度不同，消化时间不同）。

4) 当细胞成片脱落时，立刻加入4~6mL 10% 培养基停止消化，防止消化过度。将吹打动作轻柔，吹打3、5个细胞连成团即可（消化为主，吹打为辅）。将细胞悬液加入离心管，常温，1000rpm/min，离心5min。

5) 冻存液的配置：无血清培养基：血清：DMSO= 7: 2: 1。用冻存液重悬细胞团块，吹打5~8次，一瓶T75细胞可以冻存3~4管，1mL/管。

6)将冻存管标记：细胞名称、冻存日期、管理人等信息。放置在细胞冻存盒中，-80℃冷冻24h后，放在液氮罐里存储（缓冻速融）。根据需求，每年复壮1~2次。

注意事项：
1.严格进行无菌操作，所用一切试剂及耗材均应无菌，且须在无菌超净工作台中紫外照射30min以上，以免细胞发生污染。
2.进入细胞间开始细胞培养时，确定所有的细胞操作用的溶液和耗材都已经消毒并检测没有问题，不确定的溶液和耗材请勿使用，除非特殊情况，不要借用别人的溶液。
3.确定戴的手套没有问题，只要接触过生物安全柜之外的物品，必须及时对手套进行消毒。冻存液中DMSO对人体有毒，避免直接接触皮肤。
4.确定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。细胞操作时动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口在火焰周围简单转动烧灼（过分烧灼会把瓶口烧坏）。瓶盖应当倒放在远离自己的地方，以避免瓶盖被误操作所污染。
5. 细胞培养基中有许多热不稳定的成分，必须低温保存，但是培养基在接触细胞以必须要事先预热到37℃，不要把冷的培养基加入细胞内。由于培养基中的许多成分对热不稳定，比如一些抗生素在37°C时的半衰期很短，所以只在使用培养基的10 min再预热。
6.不要从敞开的容器口上方经过，以避免衣服上掉落不明物体对细胞的污染。
7.确定工作台的隔板已经放低，尽量减少谈话，打喷嚏或咳嗽绝对不能对着工作区。实验完毕及时收拾，保持工作区域清洁整齐，然后用75%酒精清洁台面。

沃卡威(北京)生物技术有限公司从事细胞治疗、分子生物学、免疫学、体外诊断等相关域的实验需求产品开发和销售。主要产品有抗原抗体|无血清培养基|细胞培养耗材并代理销售Thermo、Abcam、Armosco、Invitrogen(Gibco)、Roche、Sigma、R&D、ATCC、HYCLONE、Meridian等二十多家国外知名品牌。。单位注册资金单位注册资金人民币250-500万元。我们公司主要经营:抗原抗体,胎牛血清，凭借业的科技实力，深入研究和开发产品，也从事抗原抗体,胎牛血清的研究和生产。如果您对我公司的产品有兴趣，请在线留言或者来电咨询，欢迎来到沃卡威(北京)生物技术有限公司网站，www.wolcavi.com.

 

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