1. 检测原理

本试剂盒采用竞争法酶联免疫吸附试验（ELISA）。在预包被小鼠免疫球蛋白G（IgG）（固相抗原）的微孔酶标板中，加入小鼠免疫球蛋白G（IgG）标准品和待测样本，再加入HRP标记的抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）抗体（HRP标记抗体），经过温育与充分洗涤，去除未结合的组分，加入显色底物A和B，底物在HRP催化下，产生蓝色产物，在终止液（2M 硫酸）作用下，终转化为黄色。在酶标仪450nm波长上测定吸光度（OD值），吸光度（OD值）与待测样品中小鼠免疫球蛋白G（IgG）的浓度呈反比。拟合标准品曲线，可以计算出样本中小鼠免疫球蛋白G （IgG）的浓度。

2. 试剂盒检测的局限

1）仅供科研使用，不得用于临床诊断

2）请在本试剂盒标示的有效期内使用。

3）试剂盒的试剂不能与其他批号的试剂或其他来源的试剂混合使用。

4）任何操作人员、移液技术、洗涤技术、孵育温度、试剂盒保存时间的改变，都将影响结合反

应。

二、基本信息

1. 试剂盒提供的材料

2. 未提供的材料设备

1）能够检测 450 nm 吸光度的酶标仪

2）移液器及枪头、加样槽

3）37℃恒温箱或水浴锅

4）准备试剂用的试管、离心管、量筒等

5）蒸馏水或去离子水

6）涡旋振荡器、微孔板振荡器

3.贮存

试剂盒保存于 2 - 8℃，有效期标注于标签上（有效期一般是6个月）。只有恰当保存的试

剂才是有保证的。如果试剂盒的组分需要再次使用， 请确保上一次使用之后没有被污染。

4.注意事项

1）所有的化学试剂理应被认为具有潜在危害。

2）推荐只有经过良好实验室培训的工作人员方可操作本试剂盒。操作时请佩戴合适的防护设

施，例如白大衣、乳胶手套、安全眼镜等。

3）请避免试剂接触皮肤和眼睛。如不慎接触，请立即用大量清水清洗。

4）试剂盒中的终止液为酸性溶液，在使用终止液时，请佩戴防护服，及防护眼睛、手及面部的设施。

5）本试剂盒用于科学研究，不能用于诊断治疗。

6）请不要使用过期的试剂。

7)在试剂盒的贮存或孵育过程请避免强光照射。

8)在操作试剂盒或处理样本时请佩戴乳胶或一次性手套。

9)为了避免微生物的污染，以及试剂与样本间的交叉污染，请使用一次性枪头。

10)使用干净的容器配制试剂。

11)试剂的准备必须使用蒸馏水或去离子水。

12)显色底物在使用之必须平衡至室温。

13)液体废弃物的处理。不含酸的液体废弃物，加入 1.0 %的次氯酸钠，浸泡 30 分钟。含酸的

液体废弃物，请先中和， 再加入次氯酸钠。

三、检测准备与步骤

1.样本采集与贮存

细胞培养上清

2000 × g条件下离心20m分钟，去除细胞颗粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反

复冻融。

血清样本

离心管收集血清。血样凝集 30 分钟后，2000 × g 离心 10 分钟。吸取血清样本之后即刻

检测，或者分装，-20℃以下贮存，避免反复冻融。

血浆样本

EDTA、枸橼酸钠或肝素抗凝收集血浆样本。2000 × g 离心 20 分钟收集样本。即刻检测，

或者分装，-20℃以下贮存，避免反复冻融。

组织样本

用预冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1: 9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9 mL的PBS，具体体积可

根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，在

冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀 浆液进行超声破碎或反复冻融。后将匀

浆液5000×g离心 5-10分钟，取上清检测。

细胞提取液样本

贴壁细胞用冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g离心5分钟后收集细胞；悬浮

细 胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS 洗涤3次。每 1×106 个细胞中加入150-200μL

PBS重悬并通过反 复冻融使细胞破碎(若含量很低可减少PBS的体积)。将提取液于1500×g离心10分钟，取上清检测。

注意：1）避免样本的反复冻融，在检测，冷冻样本应缓慢地恢复至室温，轻柔混匀。

2）本试剂盒可能适用于其它生物学样本，但是未充分验证。

2.试剂准备

1）用，所有的组分都要至少复温30min，确保充分复温到室温。

2）浓缩洗涤液：从冰箱取出的浓缩洗涤液，会有结晶产生，这属于正常现象，水浴加热使结

晶完全溶解。浓缩洗涤液与蒸馏水，按1:20稀释，即1份的浓缩洗涤液，添加19份的蒸馏水。

3）标准品配置：取7个1.5ml离心管，分别标为S1-S7，先将标准品稀释100倍至10000ng/ml放入离心管S7中，再依次倍比稀释为5000ng/ml、2500ng/ml、1250ng/ml、625ng/ml、312.5ng/ml、156.25ng/ml，并分别依次装入S6-S1中。

4）HRP-抗体工作液配置：使用20min用HRP-抗体稀释液将100×HRP-抗体稀释到1×工作液，根据所需量配置，当日使用，剩余弃之。

5）TMB显色液配置：使用10min，将TMB显色液A液和B液1:1混合，避光放置备用。

6）待测样品稀释：预估样品浓度，将待测样品稀释至标准品浓度范围内。

3.检测步骤

1）试剂、样本平衡：检测之请将所有的试剂、样本平衡至室温，标准品和样品，建议做复孔。

2）加标准品、样本：设置标准品孔、样本孔和空白孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μl，

样本孔加待测样本50μl，空白孔加50μl稀释液。

3）加 HRP标记抗体：在所有孔中加入稀释后的1×HRP-抗体工作液 100μl。

4）孵育：使用封板膜封板，37℃水浴锅或恒温箱温育60分钟。

5）洗涤：弃掉液体，每孔加入350μl洗液洗板，静置1-2min，洗涤3-5次。每次洗板，在吸水纸上拍干。为获得理想的实验性能，必须彻底移除残留液体。

6）加底物显色：每孔加入100μl配置好的TMB显色液，37℃水浴锅或恒温箱温育15分钟。

7）加终止液：每孔加入50μl终止液。颜色由蓝色变为黄色。如果颜色呈现绿色或者颜色的变化明显不均匀，请轻轻叩击板框，充分混匀。

8）检测读数：在 15分钟之内，使用450nm酶标仪进行检测读数。

四、分析

1.结果计算

1）复孔的值通常在20%的差异范围内结果才有效，复孔平均值可作为测量值。

2）每个标准品或样品的吸光度值应减去本底校正孔的吸光度值(如果没有做校正孔，则不需要减

去)。

3）检测完成后，以标准品浓度做为横坐标，对应的吸光度（OD值）作为纵坐标，利用计算机软

件，采用四参数曲线拟合，创建标准曲线方程，通过样本的吸光度（OD值），利用方程计算样品的浓度值，浓度值与显色程度呈反比。

4）如果样品被稀释，通过上述方法测的的浓度值，要乘以稀释倍数，才是样品的终浓度。

2.试剂盒的性能

1）物理性能

试剂盒的各液体组分应澄清透明、无沉淀或者絮状物。微孔板铝箔袋应真空包装，无破损漏气。

2）检测范围156.25ng/ml –10000ng/ml

3)灵敏度

低可检测浓度为50ng/ml 。

4)特异性

本试剂盒识别天然和重组小鼠免疫球蛋白G（IgG）。

5)稳定性

2℃-8℃保存，有效期6个月。

说明