研究背景

炎性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD）是一种慢性肠道炎症性疾病，其症状表现为腹痛、腹泻、便血和体重减轻等。有证据表明，IBD的发生可增加结直肠癌的患病几率。随着生活水平的提高，饮食结构发生变化，高脂肪食物摄入量增多，IBD在我国的发病率呈快速增长的趋势。

目前对于IBD的治疗，尚无特异性强而毒副作用小的药物。针对IBD开发具有确切治疗效果且毒副作用低的新型药物，具有重要的科学意义和临床价值。

猴头菇是著名的药食两用真菌，其活性成分具有保护神经、降血糖、抗癌、抗氧化、抗衰老等功效，所产生的真菌蛋白具有免疫调节作用，因而为IBD新药的开发提供了可能。

研究目的

对猴头菇中的真菌免疫调节蛋白（HEP3）进行提取纯化，并将其应用于炎性肠病小鼠的治疗。通过比较不同处理间小鼠肠道的菌群差异，探索猴头菇蛋白对免疫抑制小鼠和炎性肠病小鼠的肠道菌群的影响，及其通过改变肠道菌群而产生的免疫调节作用。

研究方法

测序技术：Illumina MiSeq高通量测序平台

测序模式：微生物组细菌16S rRNA V3-V4区测序

实验设计：

1、 将小鼠随机分成4组，分别做如下处理：

2、将小鼠随机分成9组，分别做如下处理：

研究结果

1. 猴头菇蛋白HEP3对IBD大鼠的抗炎作用

HE染色和免疫组化实验结果显示，HEP3对IBD大鼠具有显著的抗炎作用。

2. HEP3是一种免疫调节蛋白

HEP3可通过上调或下调TNF-α、1L-1β、1L-6等细胞因子及iNOS的产量，对脂多糖活化的小鼠RAW 264.7巨噬细胞进行免疫调节，实现了HEP3的免疫调节作用。此外，HEP3还能够显著降低D-半乳糖诱导的HIEpiC衰老细胞的氧化应激反应，促进衰老细胞的增殖。

3. HEP3可改善小鼠体内由环磷酰胺诱导的免疫毒性

HEP3可通过活化T细胞，降低小鼠体内高剂量环磷酰胺诱导的免疫毒性。

4. 环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠的肠道菌群组成

取环磷酰胺诱导实验的4组小鼠（Z、M、D、G）的盲肠内容物进行高通量测序，对测序数据进行分析。对照组（Z）和环磷酰胺诱导组（M）两组间的Venn图、PCA主成分分析及热图分析结果显示，Z和M的微生物组成具有显著差异。与Z组相比，在属水平上，M组Oscillospira、Prevotella、Helicobacter和Bilophila的丰度有所下降，而Jeotgalicoccus、Staphylococcus、Acinetobacter、Aerococcus、Lactobacillus、Corynebacterium、Rikenell、Enterobacter、Proteus、Anaerotruncus和Trabulsiella的丰度有所增加。

四组间比较结果表明，经过HEP3处理的M组和D组具有更高的微生物物种丰富度，且4组间的群落组成具有显著差异。与M组比较发现，在门水平，HEP3处理组Actinobacteria、Bacteroidetes和Proteobacteria的物种丰度具有显著变化，但与Z组较为接近。Venn图结果显示，HEP3会改变肠道菌群组成。

在属水平，HEP3处理组的Corynebacterium、Bacteroides、Enterobacter、Acinetobacter、Desulfovibrio和Lactobacillus相对丰度增加了，但病原菌的相对丰度减少了。菌群代谢功能预测分析结果显示，环磷酰胺处理组（M）的生物代谢较为缓慢，然而经过HEP3处理后，几乎所有代谢恢复甚至高于正常水平。

 

5. HEP3通过肠道菌群增强免疫活性

实验结果表明，对于炎性肠病患者，抗生素的使用会加重结肠组织的损坏；而HEP3和Bifdobacterium均具有抗炎作用，可缓解病症，且两者之间具有协同作用。

6. HEP3显著提高了Bifdobacterium的植入活性

对Normal、TNBS、HEP3、Bifdo、TNBS +Antibiotics、HEP3+Antibiotics、Bifdo+ Antibiotics、Bifdo+ HEP3、Bifdo+ Antibiotics+ HEP3这9组小鼠的盲肠内容物进行取样测序，数据分析结果显示，在HEP3组，Bifdobacterium及其它益生菌的相对丰度是增加的，HEP3显著提高了Bifdobacterium的植入活性。

物种互作关联网络分析结果显示，在IBD小鼠肠道中，抗生素破坏了整个肠道微生态系统的菌群多样性和稳定性，而HEP3则维持了其多样性与稳定性。

7. HEP3能够抑制肿瘤生长

肿瘤抑制实验结果表明，在人类前列腺癌细胞移植模型小鼠中，HEP3可以抑制癌细胞CC531的生长。低剂量HEP3处理组（HL）和高剂量HEP3处理组（HH）对肿瘤细胞的抑制率分别为35.73%和70.61%。在HL组和HH组中，免疫和炎症相关的β2-GM、TNF-α、IFN-γ、M-CSF、TGF、VEGF等细胞因子均接近正常水平。由此可知，HEP3是一种对肿瘤具有强效抑制作用的真菌免疫调节蛋白，未来有望应用于肿瘤治疗。

总结

本研究的亮点在于，不仅通过前期免疫组化实验证实了猴头菇蛋白HEP3对炎性肠病的抗炎效果，又经过后续多次的动物实验，结合高通量测序分析，揭示了HEP3对炎性肠病的抗炎作用是通过改变小鼠肠道菌群、进而产生免疫调节实现的，两相结合，全面深入地阐明了HEP3的免疫调节作用及其作用机制。

本研究的测序和数据分析工作由上海酶远生物科技股份有限公司完成。