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兔子脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PL-A2)ELISA Kit
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上 传 者：上海酶远生物科技有限公司
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兔子脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PL-A2)ELISA Kit
参数规格：
有效期：6个月
预期应用：ELISA法定量测定血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中的含量。
保存温度：2-8℃低温保存
用途：科研实验等领域科学研究，不得用于临床诊断
应用领域：科研项目实验
操作流程：稀释——加样——温育——配液——洗涤——加酶——温育——洗涤——显色——终止——测定
常见问题：
参数规格：48T/96T
产品资料：有PDF形式、WORD形式说明书
产品优势：灵敏度高、重复性强
储存方式：2-8摄氏度（保存到冰箱里就行）
感受态细胞制备过程中应注意的问题:
1.细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5?菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）；
2.所有操作均应在无菌条件和冰上进行；
3.经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；
4.化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；
5.所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；
6.质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA；
7.一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；
兔子脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PL-A2)ELISA Kit
操作流程：
1、加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品*终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
2、温育：用封板膜封板后置 37℃温育30分钟。
3、配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用
4、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此
重复5次，拍干。
5、加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
6、显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色
10 分钟.
7、终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
8、测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
公司所售【elisa试剂盒】请贮存于2-8℃，切勿冷冻，避免阳光直晒。未使用完的酶标板条应密封，2-8℃保存，具有方便、快速、灵敏等特点，因其性质稳定、使用方便、价格低廉、在科研领域用途比较广泛，本ELISA试剂盒有效期为12个月，生产日期见批号，实验显色深，含量少，显色浅，含量多，本试剂盒灵敏度请来电详询。
工作原理：
用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗该指标抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗该指标抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成*终的黄色。颜色的深浅和样品中的该指标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。
注意事项：
1.试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。
2.实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。
3.不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
4.使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。
5.使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。
6.洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。
7.底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用8.手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。
9.加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。
10.按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
兔子脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PL-A2)ELISA Kit
ELISA标准操作及技术服务的常见问题分析：
一.ELISA 标准操作要点
优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。ELISA 中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的本公司要求使用的纯化水电导率小于1.5μs/cm。
1. 标本的采取和保存
大部分ELISA 检测均以血清为标本。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP 为标记的ELISA 测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。一般说来，在5 天内测定的血清标本可放置于4℃，标本在冰箱中保存时间过长导致血清IgG 聚合，使间接法的试剂本底加深。超过一周测定的需－20℃保存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并避免产生气泡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。
抗凝不完全的标本因纤维蛋白原的干扰而造成假阳性，建议尽量不用抗凝血尤其是肝素抗凝剂。
2.加样
加样时应将所加物加在ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出。
3.保温
在建立ELISA 方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在37℃经
1-2 小时，产物的生成可达顶峰。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。由于公司的试剂盒温育是在空气浴中完成，采用水浴会造成值偏高或花板。另外温育中还有边缘效应，边上的值会偏高，建议为了客观的判断结果，将质控放在非边缘位置。
4.洗涤
洗涤在ELISA 过程中虽不是一个反应步骤，但却决定着实验的成败。ELSIA 就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA 操作中，洗涤是*主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。
洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。
洗板时注意各种试剂盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀释，应按要求稀释，所用的水电导率在1.5us/cm 之下，洗液如果结晶应待其融解后配制。保证洗板浸泡时间为40 秒左右，孔内液体被洗板机吸收得越干净洗涤效果更好，手工洗板防止洗液在孔内形成气泡。
5. 显色和比色
TMB 经HRP 作用后，约40 分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2 小时后即可完全消退至无色。TMB 的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间（12-24 小时）不褪，是目视判断的良好终止剂。此外，各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读ELISA 结果吸光度的光度计。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001，准确性为±1%，重复性达0.5%。酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在15~30℃，使用前先预热仪器15-30 分钟，测读结果更稳定。
测读A 值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD 用492nm 波长。有的酶标仪可用双波长式测读，即每孔先后测读两次，次在*适波长（W1），第二次在不敏感波长（W2），两次测定间不 移动ELISA 板的位置，*终测得的A 值为两者之差（W1-W2）。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。
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操作流程：稀释——加样——温育——配液——洗涤——加酶——温育——洗涤——显色——终止——测定
常见问题：
参数规格：48T/96T
产品资料：有PDF形式、WORD形式说明书
产品优势：灵敏度高、重复性强
储存方式：2-8摄氏度（保存到冰箱里就行）
感受态细胞制备过程中应注意的问题:
1.细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5?菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）；
2.所有操作均应在无菌条件和冰上进行；
3.经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；
4.化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；
5.所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；
6.质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA；
7.一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；
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操作流程：
1、加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品*终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
2、温育：用封板膜封板后置 37℃温育30分钟。
3、配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用
4、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此
重复5次，拍干。
5、加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
6、显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色
10 分钟.
7、终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
8、测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
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工作原理：
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注意事项：
1.试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。
2.实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。
3.不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
4.使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。
5.使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。
6.洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。
7.底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用8.手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。
9.加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。
10.按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
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ELISA标准操作及技术服务的常见问题分析：
一.ELISA 标准操作要点
优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。ELISA 中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的本公司要求使用的纯化水电导率小于1.5μs/cm。
1. 标本的采取和保存
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抗凝不完全的标本因纤维蛋白原的干扰而造成假阳性，建议尽量不用抗凝血尤其是肝素抗凝剂。
2.加样
加样时应将所加物加在ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出。
3.保温
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1-2 小时，产物的生成可达顶峰。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。由于公司的试剂盒温育是在空气浴中完成，采用水浴会造成值偏高或花板。另外温育中还有边缘效应，边上的值会偏高，建议为了客观的判断结果，将质控放在非边缘位置。
4.洗涤
洗涤在ELISA 过程中虽不是一个反应步骤，但却决定着实验的成败。ELSIA 就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA 操作中，洗涤是*主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。
洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。
洗板时注意各种试剂盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀释，应按要求稀释，所用的水电导率在1.5us/cm 之下，洗液如果结晶应待其融解后配制。保证洗板浸泡时间为40 秒左右，孔内液体被洗板机吸收得越干净洗涤效果更好，手工洗板防止洗液在孔内形成气泡。
5. 显色和比色
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测读A 值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD 用492nm 波长。有的酶标仪可用双波长式测读，即每孔先后测读两次，次在*适波长（W1），第二次在不敏感波长（W2），两次测定间不 移动ELISA 板的位置，*终测得的A 值为两者之差（W1-W2）。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。
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