HEPENGBIO细胞总胆固醇酶连续循环比色法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途

HEPENGBIO细胞总胆固醇酶连续循环比色法定量检测试剂是一种旨在通过胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和过氧化酶的酶连续反应系统中产生的过氧化氢（H2O2），与氨基安替比林反应，生成粉红色的醌亚胺后吸光峰值的变化，即采用比色法来测定样品中总胆固醇浓度的方法。其适用于各种细胞（动物、人体等）裂解萃取样品中总胆固醇、游离胆固醇、结合胆固醇的浓度检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，检测敏感。

技术背景

胆固醇（cholesterol）是一类称之为固醇类（sterols）或聚类异戊二烯（polyisoprenoid）或三萜皂甙元（triterpene）的多环化合物（polycyclic compound）。其分子式为cholest-5-en-3β-ol。胆固醇以游离（free form）和酯化结合（ester）两种形式广泛存在于所有动物体内，主要以游离形式循环于血液中，以脂化形式传运和贮存。胆固醇在膜功能和脂代谢以及激素合成中起着重要作用，与肝脏疾病、甲状腺疾病、动脉硬化和心脏疾病密切相关。酯化胆固醇（cholesterel ester）在胆固醇酯酶（cholesterol esterase）的水解下，转化为游离胆固醇，进一步由胆固醇氧化酶（cholesterol oxidase）氧化产生过氧化氢（H2O2）。在过氧化酶（peroxidase）的催化下，过氧化氢与氨基安替比林（4-amino-antipyrine；AAP）反应，生成粉红色的醌亚胺（quinoneimine）后吸光峰值的变化（波长500nm），来定量测定总胆固醇的浓度。其酶连续反应系统为：

cholesterol esterase

cholesterol esters      →    cholesterol  +  free fatty acids

cholesterol oxidase

 cholesterol  +  O2   →    ketone  +  H2O2

peroxidase

AAP  + phenol  +  2H2O2     →    quinoneimine   +  4H2O

产品内容

HEPENGBIO清理液（Reagent A）        120毫升

HEPENGBIO萃取液（Reagent B）    5毫升

HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）    10毫升

HEPENGBIO反应液A（Reagent D）    250微升

HEPENGBIO反应液B（Reagent E）    250微升

HEPENGBIO底物液（Reagent F）    500微升

HEPENGBIO标准液（Reagent G）    200微升

产品说明书    1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里；HEPENGBIO底物液（Reagent F）和HEPENGBIO标准液（ReagentG）避免光照；6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于标准样品配制的容器

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离

微型台式离心机：用于样品制备

烘箱：用于样品萃取的孵育

恒温水槽或培养箱：用于孵育反应

平式摇荡仪：用于反应物混匀

比色皿或96孔板：用于反应和比色分析的容器

分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

一、 样品准备

1． 准备好25cm²细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1 X 10⁶细胞）

2． 小心加入3毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），覆盖生长表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）

5． 加入3毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），混匀细胞

6． 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）

7． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g

8． 小心抽去上清液（注意：确保没有液体残留）

9． 加入200微升HEPENGBIO萃取液（Reagent B），充分混匀

10． 转移到预冷的1.5毫升离心管

11． 强力涡旋震荡15秒

12． 置于冰槽里孵育30分钟

13． 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取下层溶剂液相包括膜状物到新的1.5毫升离心管

15． 置于50℃烘箱烘干1至2小时，或直至干燥为止

16． 加入200微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）（注意：如果胆固醇浓度高，会出现轻度混浊）

17． 涡旋震荡5分钟（注意：如果膜状物无法溶解，重复实验步骤13，离心5分钟，避开膜状物取上清）

18． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、 测定准备

1． 准备好上述制备的待测样品，置于冰槽里备用

2． 设定好酶标仪（温度为37℃）：波长500nm，并置零

3． 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管

4． 分别加入100微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到1至5号管

5． 移取100微升HEPENGBIO标准液（Reagent G）到1号管，混匀

6． 小心移取100微升1号管稀释的HEPENGBIO标准液（Reagent G）到2号管，混匀

7． 小心移取100微升2号管稀释的HEPENGBIO标准液（Reagent G）到3号管，混匀

8． 小心移取100微升3号管稀释的HEPENGBIO标准液（Reagent G）到4号管，混匀

9． 将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表

三、比色测定

1． 在96孔板上做好相应标记：标准样品和待测样品

2． 分别移取60微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent C）到相应孔里

3． 分别加入10微升HEPENGBIO反应液A（Reagent D）

4． （选择步骤）分别加入10微升HEPENGBIO反应液B（Reagent E）（注意：如果检测游离胆固醇，该步骤变换成加入10微升HEPENGBIO缓冲液（ReagentC）；如果检测总胆固醇，该步骤必须完成）

5． 分别加入20微升HEPENGBIO底物液（Reagent F）

6． 分别加入100微升上述配制的标准液或待测样品 

7． 盖上盖子并密闭

8． 在37℃温度下，置于平式摇荡仪孵育5分钟，速度为50RPM，避免光照

9． 即刻放进酶标仪检测：获得吸光读数（OD）

10． 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光单位（OD）；横座标（X轴）为标准胆固醇浓度（微摩尔/升）

11． 根据标准曲线获得样品对应胆固醇浓度（微摩尔/升）

12． 计算样品实际胆固醇浓度

[根据标准曲线获得样品对应胆固醇浓度（微摩尔/升）X样品稀释倍数] ＝纳摩尔胆固醇/毫升 ÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝纳摩尔胆固醇/毫克 

13． 总胆固醇、游离胆固醇、结合胆固醇计算方法：

总胆固醇＝反应体系包涵HEPENGBIO反应液B（Reagent E）的反应结果计算所得

游离胆固醇＝反应体系不包涵HEPENGBIO反应液B（Reagent E）的反应结果计算所得

结合胆固醇＝总胆固醇－游离胆固醇

注意事项

1． 本产品为20次（总胆固醇或游离胆固醇）操作

2． 本产品的检测灵敏度为10微摩尔/升（4微克/毫升）

3． 操作时，须戴手套

4． 建议样品保存在-70℃冰箱里，如果保存在4℃冰箱里，其稳定性保持1周，-20℃保持3月

5． 高浓度胆固醇会出现轻度混浊，可以使用乙醇稀释

6． 系统操作过程中，标准液测定只需1次

7． 孵育反应完成后即刻进行比色测定

8． 样品比色检测可以使用分光光度仪和比色皿替代

9． 如果胆固醇浓度过低，可以增加孵育时间至30分钟

10． 比色测定后，使用比色皿的，须清洗

11． 如果用户没有匹配的滤波器，可以使用480nm至520nm之间的任一波长

12． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

原创作者：赫澎（上海）生物科技有限公司