脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）活性试剂盒

微量法

注意：正式测定之选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

货号: YX-W-A108

规格: 100T/96S

产品内容：

试剂一：液体 100ml×1 瓶，-20℃保存。用 1 d 取出置于 4℃充分解冻后混匀。

试剂二：粉剂×1 支，-20℃保存。临用加入 440 μL 试剂四，充分溶解。

试剂三：粉剂×1 支，-20℃保存。临用加入 440 μL 试剂四，充分溶解。

试剂四：液体 20ml×1 瓶, 4℃保存。

试剂五：粉剂×1 支，-20℃保存。临用加入 840μL 试剂四，充分溶解。

试剂六：液体 2ml×1 瓶, 4℃保存。

产品简介：

FAS 是脂肪酸合成关键酶，催化乙酰辅酶 A 和丙二酰辅酶 A 而生成长链脂肪酸。FAS 普遍表达于各种组织细胞中，在哺乳动物肝、肾、脑、肺和乳腺以及脂肪组织中表达丰富。

FAS 催化乙酰 CoA、丙二酰 CoA 和 NADPH 生成长链脂肪酸和 NADP同时还原特异性底物，在450nm处有特征吸收峰。

试验中所需的仪器和试剂：

研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、可调式移液枪和蒸馏水。

操作步骤：

一、粗酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积（mL）为 1:5-10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入

1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。16000rpm，4℃离心 40min，取上清置于冰上待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500-1000:1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 ，间隔 7 ，总时间 3 分钟）；然后 16000rpm，4℃离心 40min，取上清置于冰上待测。

二、FAS 测定操作：

1. 分光光度计预热 30min，调节波长到 340 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂四置于 37℃水浴中预热 30 min 以上。

3. 空白管：在 500μLEP 管中依次加入 20μL 蒸馏水、4μL 试剂二、4μL 试剂三、154μL 试剂四、8μL 试剂五和10μL 试剂六 ，迅速混匀后于 450nm 处测定吸光值，记录第20min时吸光值，记为△A 空。

4. 测定管：在 500μLEP 管中依次加入 20μL 上清液、4μL 试剂二、4μL 试剂三、154μL 试剂四、8μL

试剂五和10μL 试剂六，迅速混匀后于 450nm 处测定吸光值，记录第20min时吸光值，记为△A 测。

三、FAS 活性计算：

使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

1. 按照蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1μmol NADPH 为 1U。

FAS(U/mg prot) =[(△A 测定管–△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×106] ÷(Cpr×V 样)÷T

2. 按照样本质量计算

活性单位定义：37℃中每克组织每分钟氧化 1μmol NADPH 为 1U。

FAS(U/g) =[(△A 测定管–△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×106] ÷(W×V 样÷V 样总)÷T

3. 按细胞数量计算

活性单位定义：37℃中每 104 个细胞每分钟氧化 1μmol NADPH 为 1U。

FAS(U/104 cell ) =[(△A  测 定 管 –△A  空 白 管 )÷ε÷d×V  反 总 ×106]  ÷( 细 胞 数 量 ×V  样 ÷V  样总)÷T

ε：特异性底物的消光系数，3.1×10⁴ L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V 反总：反应体系总体积， 200μL=2×10-4 L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，V 样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；T：反应时间，20min。

使用 96 孔板测定的计算公式如下：

（1） 按照蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1μmol NADPH 为 1U。

FAS(U/mg prot) =[(△A 测定管–△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×106] ÷(Cpr×V 样)÷T

（2） 按照样本质量计算

活性单位定义：37℃中每克组织每分钟氧化 1μmol NADPH 为 1U。

FAS(U/g) =[(△A 测定管–△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×106] ÷(W×V 样÷V 样总)÷T

（3） 按细胞数量计算

活性单位定义：37℃中每 104 个细胞每分钟氧化 1μmol NADPH 为 1U。

FAS(U/104 cell ) =[(△A  测 定 管 –△A  空 白 管 )÷ε÷d×V  反 总 ×106]  ÷( 细 胞 数 量 ×V  样 ÷V  样总)÷T

ε：特异性底物的消光系数，3.1×10⁴ L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5 cm；V 反总：反应体系总体积， 200μL=2×10-4 L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，V 样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；T：反应时间，20min。

注意事项：

1.上清液蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。

2.如（△A 测定管–△A 空白管）大于0.6，可稀释样本后再进行检测，计算时需乘于相应稀释倍数。

3.如样本量较多，可将试剂二、 试剂三、试剂四、试剂五、试剂六按照4：4：154：8：10配置混合工作液进行添加（工作需现配现用）。