货号：YX-W-C300                                                规格：100管/96样

线粒体复合体Ⅰ试剂盒说明书

微量法

正式测定务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

复合体Ⅰ（EC 1.6.5. 3）又称NADH-CoQ 还原酶或NADH脱氢酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体内膜中大的蛋白复合物。该酶催化一对电子从NADH 传递给CoQ，同时可使O₂还原生成O^2.-，是呼吸电子传递链上产生O^2.-的主要部位。测定该酶活性，不仅可以反映呼吸电子传递链（ETC）状态，而且可以反映活性氧（ROS）生成状态。

测定原理

复合体Ⅰ能够催化NADH脱氢生成 NAD⁺，在340nm下测定NADH的氧化速率计算出该酶活性的大小。

需自备的仪器和用品

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

试剂一：液体 100mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂二：液体 20mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂三：液体 1.5mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂四：液体 25mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂五：液体 1mL×1 支，-20℃保存；

试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存，用时加入2mL蒸馏水，现配现用。

工作液的配制：临用将试剂五转移到试剂四中混合溶解；现配现用；

样本的处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

① 准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

② 将匀浆600g，4℃离心 5min。

③ 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅰ（此步可选做）。

⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入200uL试剂二和2uL试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10，重复30次），用于复合体Ⅰ酶活性测定。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1）工作液于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min。

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、200μL工作液和15μL试剂六，混匀，记录340nm处初始吸光值A1和2min 后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

复合体Ⅰ活力单位的计算

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

（1）按蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅰ活力（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T

=1808×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2） 按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅰ活力（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W×V样÷V样总)

÷T=365×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅰ活力(nmol/min/10⁴cell)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.73×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2.25×10^-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2 min；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。

b.使用 96 孔板测定的计算公式如下：

（1）按蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅰ活力（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T

=3616×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2） 按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅰ活力（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V样÷V样总)

÷T=730×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅰ活力（nmol/min/10⁴cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V样÷V样总) ÷T=1.46×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2.25×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；

T：反应时间，2 min；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。