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免疫组化实验步骤
点击次数：185 发布时间：2016/8/31 9:06:36
免疫组化实验步骤，一. 试剂配制
1. 0.01 M PBS(pH 7.34 )
9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB加双蒸水至1000 ml；1000 ml 0.2 M PB (pH 7.4)＝5.93 g NaH2PO4·2H2O＋58.02 g Na2HPO4·12H2O in 1000 ml双蒸水或＝190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH2PO4·2H2O：15.6 g in 500 ml ddH2O；B. 0.2 M Na2HPO4·12H2O：71.632 g in 1000 ml dH2O）。
2. Citrate Buffered Saline（0.01 M柠檬酸缓冲液，pH6.0）
28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH2O（A.Citrate acid（柠檬酸）：10.5 g 加双蒸水至1000 ml；B.Citrate sodium（柠檬酸钠）：29.41 g加双蒸水至1000 ml）。
3. 细胞通透液
由终浓度分别为0.3%双氧水和0.3%Triton X-100混合而成。配制方法是先用微波加热的36 ml PBS，再接着加120 ul TritonX-100，并加热一会儿，冷却至临用前加0.4 ml 30％H2O2。
4. 5％羊血清或封闭血清，用PBS稀释。
5. 含0.03％H2O2的0.05％DAB（避光）：用20×DAB（1％，10 mg/ml）5 ul＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。
6. 一抗、二抗均用PBS稀释。
7. Xylene、梯度Ethanol（100％×2、95％、80％、70％、50％）、双蒸水、中性树胶（封裱剂）。
8. 苏木精染液
免疫组化实验步骤，二. 操作步骤
1. 脱蜡、水化
（1）60 ℃×20 min→Xylene 2 ×10 minutes；
（2）100% absolute ethanol：2 ×5 minutes；
（3）95% ethanol 2 minutes；
（4）80% ethanol 2 minutes；
（5）70% ethanol 2 minutes；
（6） distilled water：5 min；
（7）PBS洗3次×3 min。
2、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶
（1）用封闭通透液浸润切片30 min（RT避光）。配法是用预热40 ml PBS加120 ul TritonX-100加热几分钟后，临用前加400 ul 30％H2O2。
（2） PBS溶液洗3次×3 min。
3、抗原修复暴露抗原决定族
（1） 切片放入0.01 M柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0）后，在微波炉里高火4 min至沸腾后，再加热约6 min×4次，每次间隔补足液体，防止干片。
4、封闭非特异性蛋白
（1） PBS溶液洗3次×3 min；
（2）将切片取出，周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入5%羊血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中,室温30（10～30）min；
5、一抗孵育
（1） 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（1：250、500、1000）后，放入湿盒中室温1小时，然后4度过夜，从冰箱中取出需37 ℃复温45 min。
6、二抗孵育
（1）将一抗倒掉并用PBS洗5 min×5次；
（2） 用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入37 ℃恒温烤箱中30 min（回收）。
（3）用PBS洗5次×5 min；
7、SP反应
（1） 加入SP后放入37度烤箱中30 min。
（2） 用PBS洗5次×5 min；
8、显色
（1）加入DAB（快速滴入，观察染色情况，倒掉染液），显色时间控制在约5 min（3～10 min），由镜下观察颜色控制时间。
0.05％DAB（避光）（1：20储备液）：5 ul 20×DAB＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。1%DAB储备液的配制：50 mg DAB+5 ml 0.05 mol/L PBS充分溶解，-20 ℃保存。
9、复染、脱水、透明、封片
（1）用PBS 3次×3min后，用双蒸水洗5 min；
（2）加一大滴苏木素染液，胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋白染20 s后自来水冲洗，双蒸水洗5 min，再用PBS返蓝5 min。
（3）脱水
（4）透明
Xylene 1×(1-2) min→Xylene 2×(1-2) min
（5） 封片
中性树胶。
免疫组化实验步骤
原创作者：上海雅吉生物科技有限公司
