PB S /叠氮钠.•含有0.02% (m /V ) 叠氮 钠 的 PBS (附 录 1 ) ( 可长期保存于4°C 或室温）

3m ol/L NaSCN

同种非磷酸肽亲和基质层析柱（3m l 柱床体积；见辅助方案1 和 2)

同源磷酸肽亲和基质层析柱（可选； 3m l 柱床体积；见辅助方案1 和 2)

阳性选择的磷酸肽亲和基质层析柱（3m l 柱床体积；见辅助方案1 和 2)

3.5m ol/L 和 4. 5m ol/L MgCl2 (可选）

透 析 袋（M W C O 12 000〜14 0 0 0 ; 宽 10m m ，直径 6. 4m m ; 如 Spectrum 的 Spectra/Por 4)

注 ：所有以下的层析步骤均在室温下进行，液体均以重力作用上柱。

1 . 将洗涤后的B S A -琼脂糖与磷酸酪氨酸亲和基质层析柱相连。

2 . 将 15m l 的粗制血清通过重力作用流过两柱，以 PBS/叠氮钠洗，直到所有黄色血清均 通 过 层 析 柱（或以分光光度计测流出液的A 28。吸光度，直至达到基线）。再 以 5〜IOml P B S /叠氮钠洗柱，收集所有穿出液，其中可能含有目的抗体。

每 一 次 过 柱 后 血 清 的 体 积 会 增 加 ， 这 将 延 长 下 一 次 过 柱 的 时 间 。 如 果 通 过 观 察血 清 的 黄 色 程 度 来 确 定 液 体 流 穿 的 进 程 ， 则 血 清 越 被 稀 释 后 就 越 不 容 易 观 察 。

3 . 可选：留取部分粗制血清组分及次的穿出液，用于后续分析及对比每一次纯化的组分。如果有必要，可立即通过免疫印迹对含有多种磷酸化酪氨酸蛋白的样本进行 分 析（单 元 12. 5)，以排除无反应的组分。也可以留取部分纯化的组分用于接下来的分析，然后继续下一步骤。

4 . 血清过柱后，以 1 0 倍柱床体积的3mol/L N a S C N 和 10倍柱床体积的P B S /叠氮钠再生柱子， 4°C 保 存 于 P B S /叠氮钠中备用。

5 . 将穿出的血清组分尽量多次过同种非磷酸肽亲和基质柱，以尽量减少交叉反应。以10倍柱床体积的3mol/L N a S C N 和 1 0 倍柱床体积的PBS/叠氮钠再生柱子。分析每次或多次过柱的血清或保留部分组分待以后分析。

6 . 如果预期与同源的磷酸蛋白有交叉反应，则 使 用 步 骤 5 中提供的方法使穿出的血清组分通过同源磷酸肽亲和基质柱。

7 . 在收集阳性选择亲和纯化的穿出峰之前，将 25c m 的透析袋水化并洗涤。透析袋一端用透析夹夹紧，检查是否渗漏，配 制 6L PBS/叠氮化合物， 4°C 保存用作透析液。

8 . 将上次层析步骤所得到的流穿血清通过阳性选择的磷酸肽亲和基质柱3 次（使抗体亲和基质的相互作用化），在每次之间不需洗柱。

9 . 收集*后一次穿出的血清，用 5〜20m l 的 P B S /叠 氮 钠 洗 柱（根据柱前体积和柱床体积），将洗涤物与流穿的血清合并，另 用 20m l 的 P BS/叠氮钠洗柱，收集流穿液体作为 「洗涤」峰 。

10.以多种促溶剂洗脱：可 以 选 用 20m l 3mol/LNaSCN (*佳选择）或 10m l 3.5mol/LMgCl2 (可能会产生沉淀，减慢流速）洗脱后加I O m U .5mol/L MgCl2洗脱。开始洗脱时，立即收集每份3m l 洗脱液到步骤7 中准备的透析袋中，用透析夹将近端的袋口夹紧并立即投入PBS/叠氮钠透析液中。或者也可以收集3m l 洗脱液到透析管中，一旦收集每一组分完毕，立即将透析液加人透析管中。收集至少6 个 组 分（大多数抗体在前 3 个组分中， 2〜3 个柱床体积），如前所述再生柱子（步 骤 4)。

11.在 P B S /叠氮钠中于4°C 对 步 骤 1 0 收集的所有组分进行彻底透析。

12.检 测 280n m 吸光度或用蛋白比色法测定透析后组分的蛋白质浓度，并 计 算 产 量（15 ml血清得到> l m g 纯化抗体）。分装抗体保存于一70°C ，正在使用的抗体保存于4°C 。

13.用 ELISA (单元L I ) 或 免 疫 印 迹（单 元 12. 5 ) 分析*终样本以及以前步骤中保存的纯化组分的反应性和交叉反应性。

原创作者：郑州市国达仪器设备有限公司