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T淋巴细胞转化实验
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文件大小：34kb
上传时间：2016/9/21 9:45:51
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上 传 者：上海雅吉生物科技有限公司
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实验方法原理T 细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原（如PHA、ConA）刺激后，可出现细胞体积增大，代谢旺盛，蛋白和核酸合成增加,即向淋巴母细胞转化。淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的细胞免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能的指标。 
淋巴细胞转化试验有形态计数法、MTT 法和同位素法三种。
MTT 法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法。MTT 是一种噻唑盐，化学名3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑，水溶液为黄橙色。小鼠脾细胞受到ConA 作用后发生增殖活化，其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，MTT 作为其底物参与反应，形成蓝色的甲臜（Formazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经盐酸─异丙醇溶解后为蓝色溶液，可用酶标测定仪测定细胞培养物的OD 值，测定波长570 nm。根据OD 值的大小计算反应体系中细胞增殖程度。
3H-TdR 掺入法：细胞增殖的基本条件或前提为细胞质和细胞核的复制，这是正常细胞增殖过程缺一不可的前提。一般来说，一个细胞周期可大致分为四期，即G1 期、S期、G2 期和M期。其中S期为DNA合成期，主要功能活动为DNA合成。3H-TdR即（甲基-3H）胸腺嘧啶核苷（[3H-methyl]thymidine），是DNA合成的前体。加入细胞培养液中后被细胞摄取作为DNA合成的原料。细胞合成的DNA越多，则所掺入的3H-TdR就越多，因此，检测所掺入的3H-TdR就可反映细胞增殖的程度。因该方法有同位素污染问题，故我们实习中仍用MTT法。
实验材料ICR小鼠
试剂、试剂盒RPMI1640培养液Hank＇s液刀豆蛋白AMTT碘酒酒精
仪器、耗材无菌尖吸管刻度吸量管无菌解剖器械平底培养板CO2培养箱酶标测定仪
实验步骤
1. 小鼠脾细胞悬液的制备
取一个灭菌的平皿，加入5 ml Hank＇s液。颈椎脱臼法处死小鼠，取脾脏，放入平皿中，在钢网上研磨并过筛，制成细胞悬液。取出100 μl用于计数。将其余细胞悬液移入一离心管中，离心1500 rpm，7 min，（或1000 rpm，10 min）弃去上清，用RPMI1640 培养液稀释，制成2.5×106 /ml的脾细胞悬液，然后加入ConA使每孔*终浓度为2 μg/ml，同时做不加ConA的阴性对照孔。
2. 将上述细胞悬液加入96孔平底培养板中，每孔0.1 ml。
3. 将培养板放入含有5 %CO2的37 ℃培养箱中培养48-72 小时，在培养结束前4-6 小时，于培养板各孔内加入1 mg/mlMTT液，10 μl/孔。37 ℃培养6 小时。
4. 各孔内加入0.01 M 盐酸—异丙醇110 μl，30 分钟内（或加2 %SDS100 ul/孔，过夜）用酶标测定仪测OD 值，测定波长570 nm。
收起
注意事项
1. 由于本实验需要培养3 天，才能观察结果。因此，在操作时应注意无菌操作，避免细菌污染，导致实验的失败。
2. 细胞操作要轻柔、迅速，以免细胞损伤影响实验结果。
收起
其他
一、实验结果
将实验组和对照组三个复孔的 OD 值平均。
转化值=实验组的平均OD 值-对照组的平均OD 值。
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