Biotechnology Co., Ltd. Shanghai enzyme research

        This kit is for in vitro research use, not for clinical diagnosis!

              （本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断！）

             小鼠皮质醇(Cortisol)酶联免疫分析试剂盒                                              

                     Mouse(Cortisol)ELISA Kit

                             CAS.NO:Ek-M21263 

    声明：尊敬的客户，感谢您选用本公司的产品。本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆及相关液体样本中皮质醇(Cortisol)含量。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分！如有疑问，请及时联系我们。

试剂盒组成：

实验原理

    本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠皮质醇(Cortisol)水平。用纯化的小鼠皮质醇

(Cortisol)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入皮质醇(Cortisol)，

再与HRP 标记的皮质醇(Cortisol)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成*终的黄色。颜色的深浅和样品中的皮质醇(Cortisol)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中小鼠皮质醇(Cortisol)浓度。         

标本要求 

1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成应再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。

5. 培养细胞:检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

6. 组织标本:切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），或组织蛋白萃取试剂, 用手工或匀浆器将标本匀浆化。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

7. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融

8.不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

试验所需自备物品:

1. 酶标仪(450nm波长滤光片)

2. 高精度移液器，EP管及一次性吸头

3. 37℃恒温箱，双蒸水或去离子水

4. 吸水纸

操作步骤

1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品*终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。   

4. 配液：将30倍（48T 的20 倍）浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用

5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

8. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟.

10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

计算

  以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

注意事项

1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4． 请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请*后乘以总稀释倍数（×n×5）。

5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物请避光保存。

7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

9．本试剂不同批号组分不得混用。

实验目的、灵敏度、检测范围和重复性:

●实验目的：测定小鼠血清、血浆及相关液体样本中皮质醇(Cortisol)含量。

●灵敏度：*小可测         4.8μg/L。

●检测范围          8μg/L -240μg/L。

●重复性：板内，板间变异系数均<10%。  

问题分析

若实验效果不好，请及时对显色结果拍照，保留所用板条及未使用试剂，并妥善保存，然后联系我公司技术支持为您解决问题。同时您也可以参考以下资料：

声明

1. 限于现有条件及科学技术水平，尚不能对所有原料进行全面的鉴定分析，本产品可能存

在一定的质量技术风险。

2. *终的实验结果与试剂的有效性、实验者的相关操作以及当时的实验环境密切相关，请

务必准备充足的待测样品。

3. 只有全部使用试剂盒内的试剂才能保证检测效果，不能混用其他制造商的产品。只有严

格遵守本实验说明才会得到*佳的检测结果。

4. 有效期：6 个月。

使用前请仔细阅读说明书。如果有任何问题，请通过以下方式联系我们：

联系时请提供产品货号，以便我们更高效地为您服务。 谢谢！

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原创作者：上海酶研生物科技有限公司