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二、使用方法

客户收到EBTr [NBL-4]细胞株后，请按照以下方法进行操作。

1.         收到细胞，请查看瓶子是否有破裂，培养基是否漏出，是否浑浊，如有请尽快和我们联系。

2.         如包装完好，取出25cm²培养瓶，75%酒精消毒,拆下封口膜,在显微镜下观察细胞形态是否正常，细胞的贴壁情况以及细胞密度,然后放入37℃，5%CO₂细胞培养箱中静置2-3小时，以稳定细胞状态。

3.         细胞状态稳定后，弃除培养瓶中大部分液体，只剩5-10ml左右培养液继续培养就可以了，超过80%汇合度时，请按细胞培养条件传代培养。

4.         细胞传代

1)        吸出25cm²培养瓶中的培养基,用PBS 2-3ml清洗细胞一次；

2)        添加0.25%胰蛋白酶消化液约1.5ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后吸弃消化液，再加入完全培养液终止消化；

3)        用吸管轻轻吹打混匀，按1:2等适当的比例进行接种传代，然后补充新鲜的完全培养基至5ml，放入37℃，5%CO₂细胞培养箱中培养；

4)        待细胞完全贴壁后，培养观察。之后每隔2-3天更换新鲜的完全培养基。

三、注意事项

1.         在EBTr [NBL-4]细胞株培养过程中，请注意保持无菌操作；

2.         传代培养过程中，胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞贴壁及其生长状态；

3.         EBTr [NBL-4]细胞株只可用于科研。

四、冷冻保存细胞之方法

     冷冻保存方法一: 冷冻管置于4℃(30－60 分钟)→-20℃( 30 分钟) → -80℃(16－18 小时或隔夜)→ 液氮罐长期储存。

     冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3℃至–80 ℃以下， 再放入液氮中长期储存。注意：-20℃不可超过1 小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

五、细胞复苏

    取出冷冻管后，须立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1－2 分钟内大部分融化，特别注意，需残留一小块冰块，就可拿到超净工作台操作细胞，用75％消毒冻存管，用新鲜培养基将细胞转移至培养瓶。另外冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。

   刚收到细胞时，胎牛血清可以用15%培养两三天，利于细胞尽快恢复状态，细胞稳定后

再调回10%即可。www.elisakits.cn

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