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ELISA试剂盒实验的意义与优点
点击次数：166 发布时间：2017/1/3 16:06:05
一、论洗涤的重要性
1. elisa试剂盒*后一次洗涤一定要彻底！这一过程不是是反应聚，但却是决定实验成败的关键！在ELISA测定的反应过程中应尽量避免非特异性吸附，应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。洗涤如不彻底，特别在*后一次，如有酶结合物的非特异性吸附，将使空白值升高。另外，在间接法中如血清标本内的非特异性IgG吸附在固相上而未被洗净，也将与酶标抗体作用而产生干扰。
2. 洗板方法的选择
① 自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
② 手工洗板方法：吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。
阴性和空白值高有几种可能：
① 酶标抗体浓度过高
② 显色时间太久，显色温度过高(可以试一下室温)
③ 板条封闭不完全
④ 板条吸附性太强，造成本底过高
在没有洗板机的情况下，手洗需要注意几点：
① 一定要甩液，垂直和斜甩都不要紧，只要能保证一次将孔中的液体甩尽就好了。
② 选用的拍板纸不起碎屑的就可以了（防止到孔中影响结果测定）。
③ 洗板时每次用洗液浸泡1-2min，共洗5次就差不多了。
3. 洗涤参数
洗涤量：自动洗板机会分配洗涤液。如果您之前遭遇过高背景，那么不要犹豫，将洗涤量调为高，是比包被体积更高。太少的洗涤液会让一部分分析表面洗涤不到，从而明显增加背景。所有反应孔的洗涤量必须相同。ELISA板的制造商通常会在试剂盒的使用手册中列出包被量。行业中通常使用的包被量是200 μl。
如果您你的试剂盒也是这样，那么制造商可能会建议使用300 μl洗涤液进行洗涤，以便清洁整个反应孔的壁。一般来说，洗涤量越高，则孵育步骤残留的抗体或抗原量就越少。
4. 清洗液
ELISA试剂盒一般采用0.01Mol/L pH 7.2 PBS吐温缓冲液。吐温是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，为非离子型的表面张力物质，常做助溶剂。吐温的编号依聚合山梨醇所结合的脂肪酸种类不同而定。吐温20是结合月桂酸、吐温40是结合棕榈酸、吐温60是结合硬脂酸，吐温80是结合油酸等。通常用吐温20加入缓冲液内做为湿润剂，以减少非特异性吸附。也可在PBS缓冲液中加入1%牛血清白蛋白(或10%小牛血清或卵清蛋白)，特别在抗原包被以后，以牛血清白蛋白缓冲液再包被一次，而占据孔内剩下位置，这样来减少非特异性反应。
1. elisa试剂盒*后一次洗涤一定要彻底！这一过程不是是反应聚，但却是决定实验成败的关键！在ELISA测定的反应过程中应尽量避免非特异性吸附，应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。洗涤如不彻底，特别在*后一次，如有酶结合物的非特异性吸附，将使空白值升高。另外，在间接法中如血清标本内的非特异性IgG吸附在固相上而未被洗净，也将与酶标抗体作用而产生干扰。
2. 洗板方法的选择
① 自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
② 手工洗板方法：吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。
阴性和空白值高有几种可能：
① 酶标抗体浓度过高
② 显色时间太久，显色温度过高(可以试一下室温)
③ 板条封闭不完全
④ 板条吸附性太强，造成本底过高
在没有洗板机的情况下，手洗需要注意几点：
① 一定要甩液，垂直和斜甩都不要紧，只要能保证一次将孔中的液体甩尽就好了。
② 选用的拍板纸不起碎屑的就可以了（防止到孔中影响结果测定）。
③ 洗板时每次用洗液浸泡1-2min，共洗5次就差不多了。
3. 洗涤参数
洗涤量：自动洗板机会分配洗涤液。如果您之前遭遇过高背景，那么不要犹豫，将洗涤量调为高，是比包被体积更高。太少的洗涤液会让一部分分析表面洗涤不到，从而明显增加背景。所有反应孔的洗涤量必须相同。ELISA板的制造商通常会在试剂盒的使用手册中列出包被量。行业中通常使用的包被量是200 μl。
如果您你的试剂盒也是这样，那么制造商可能会建议使用300 μl洗涤液进行洗涤，以便清洁整个反应孔的壁。一般来说，洗涤量越高，则孵育步骤残留的抗体或抗原量就越少。
4. 清洗液
ELISA试剂盒一般采用0.01Mol/L pH 7.2 PBS吐温缓冲液。吐温是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，为非离子型的表面张力物质，常做助溶剂。吐温的编号依聚合山梨醇所结合的脂肪酸种类不同而定。吐温20是结合月桂酸、吐温40是结合棕榈酸、吐温60是结合硬脂酸，吐温80是结合油酸等。通常用吐温20加入缓冲液内做为湿润剂，以减少非特异性吸附。也可在PBS缓冲液中加入1%牛血清白蛋白(或10%小牛血清或卵清蛋白)，特别在抗原包被以后，以牛血清白蛋白缓冲液再包被一次，而占据孔内剩下位置，这样来减少非特异性反应。
原创作者：上海谷研生物科技有限公司
