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家兔肺泡巨噬细胞的分离和纯化操作说明
家兔肺泡巨噬细胞的分离和纯化操作说明
1.取2～3公斤重的家兔，耳缘静脉注射10ml空气处死动物或注射2ml(含130mg)戊巴比妥麻醉动物。仰卧固定，消毒胸部，剪开胸壁。以下过程注意无菌操作。小心从环状软骨下方剪下气管，分离心脏和血管，取出肺，剪去脂肪和结缔组织。用无菌纱布小心擦净肺表面，称重。
2.分离肺泡巨噬细胞系：用夹子夹住气管，使肺悬空。向气管中注射40ml无菌的冷生理盐水，让生理盐水进入全部肺泡。用镊子提起气管，从夹子下面剪断气管，将肺中的液体倒入离心管中。再用同样方法，用40ml无菌冷生理盐水冲洗肺泡，合并浸出液，置4℃。
3.分离肺组织中的巨噬细胞：取出肺泡巨噬细胞后，剪去气管，将肺组织放在有冷RPMI-1640培养液的平皿中。平皿置冰上，用吸满冷RPMI-1640培养液的20ml注射器接23号针头，一边灌注一边用针头梳离肺组织，直到肺组织与支气管树全部分离。使肺组织通过200目的钢丝网，分离单个细胞。
4.以下过程均在4℃中进行。分别处理肺泡巨噬细胞和肺组织中的巨噬细胞：离心200×g 10分钟，去上清液。轻弹试管，悬浮细胞系，加入10ml低渗液(20mmol/L Tris, 0.75%氯化铵，pH7.4)，37℃处理3～5分钟，溶解红细胞。红细胞通常分别占肺泡巨噬细胞和组织巨噬细胞的1%和10%。也可以不用低渗处理，直接在淋巴细胞分离液上分离巨噬细胞。
5.离心200×g 10分钟，去上清液。用RPMI-1640培养液洗涤细胞一次。将细胞悬液加在淋巴细胞分离液(比重1.077)上，离心400×g 20分钟，收集交界面的巨噬细胞。弃去沉淀的死细胞和红细胞。
6.用RPMI-1640培养液洗涤巨噬细胞2次。台盼蓝染色检测细胞活力和细胞数，将细胞配成所需浓度。此时巨噬细胞活力可达90%以上，巨噬细胞占全部细胞系的90%以上。
原创作者：上海谷研生物科技有限公司
