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免疫共沉淀的elisa试剂盒实验流程和注意事项
点击次数：166 发布时间：2017/4/11 15:40:45
免疫共沉淀的elisa试剂盒实验流程为：
1. 转染后24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C， 转速离心30 min后取上清；
2. 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育；
3. 取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min；
4. 将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连；
5. 免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次；*后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟；
6. SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。
免疫共沉淀的elisa试剂盒实验流程注意事项：
1. 细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。
2. 使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用
3. 使用对照抗体：
单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗
兔多克隆抗体：正常兔IgG
原创作者：上海谷研生物科技有限公司
