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分享蛋清溶菌酶操作步骤
点击次数：362 发布时间：2017/10/31 10:36:16
(一)蛋清溶菌酶的分离提取
1.变性与等电点选择性沉淀：取新鲜蛋清用1%NaCl-0.05mol/LHCl 溶液搅拌稀释，加20%HAc 调至pH4.6，3000r/min 离心10min，收集滤液并记录体积，留样2mL(Ⅰ)待分析。将滤液置于沸水浴使3min 内迅速升温至75℃，用流动水速冷后，3000r/min 离心20min，收集上清液，纪录体积，并留样2mL(Ⅱ)待分析。
2.丙烯酸处理：将所得清液(pH6.0左右)中滴加10%聚丙烯酸(用量为清液体积的1/4)，慢速搅拌，当凝聚物出现后，静置30min 使凝聚物粘附于容器底部。倾去上清液，加入蒸馏水约1mL，并滴加少量0.5mol/LNa2CO3，使沉淀溶解，此时溶液pH6左右。搅拌条件下向溶液中滴加500g/LCaCl2(体积为聚丙烯酸量的1/12.5)，生成的沉淀挤压干后弃去。如所得溶液不够澄清，可以进行离心或简单过滤，并用少量水洗涤滤纸。收集滤液于刻度试管，记录体积，留样0.5mL(Ⅲ)待分析。
3.Sephadex G-50 柱层析
(1)装柱：称取15g Sephadex G-50，加入300mL 蒸馏水溶胀6小时以上，置热水浴中加热除去气泡，冷却后装入玻璃层析柱。用6g/LNaCl 溶液200mL 平衡层析柱。
(2)上样：向样液中加入固体NaCl 使终浓度为50g/L，上样时先吸去层析柱凝胶面上的溶液，再沿管壁滴加样品，样品量不宜超过10mL。加完后打开层析柱出口，让样品均匀流入凝胶内。
(3)洗脱：样品流完后，先分次加入少量6g/LNaCl 洗脱液洗下柱壁上的样品，然后接通蠕动泵，继续6g/LNaCl 洗脱，调节操作压力使流速控制在7~8mL/10min，部分收集器收集，10min 一管，共收集200mL 左右。
(4)分析：纪录各管体积，紫外光吸收法测定各管中蛋白质浓度。合并含有蛋白质的收集管，草酸鉴定Ca2+ ，留样(Ⅳ)待分析。
4.乙二醇浓缩：将洗脱液放入透析袋，外面裹以聚乙二醇，置于加盖容器中。当酶液水分被聚乙二醇吸收而浓缩至5mL 左右时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇，倒出浓缩液，记录体积，留样
0.5mL(Ⅴ)待分析。
(二)溶菌酶活力测定
取上述各待测酶液稀释30~50倍，进行酶活测定。用微量进样器取酶液样品10μL，加入0.5mL 的0.5mol/L 磷酸缓冲液(pH6.5)，混合均匀，37℃预热2min，然后加入同样已预热过的菌悬液0.5mL。37℃保温反应15min 后，用2mL 乳化剂停止反应。
1.变性与等电点选择性沉淀：取新鲜蛋清用1%NaCl-0.05mol/LHCl 溶液搅拌稀释，加20%HAc 调至pH4.6，3000r/min 离心10min，收集滤液并记录体积，留样2mL(Ⅰ)待分析。将滤液置于沸水浴使3min 内迅速升温至75℃，用流动水速冷后，3000r/min 离心20min，收集上清液，纪录体积，并留样2mL(Ⅱ)待分析。
2.丙烯酸处理：将所得清液(pH6.0左右)中滴加10%聚丙烯酸(用量为清液体积的1/4)，慢速搅拌，当凝聚物出现后，静置30min 使凝聚物粘附于容器底部。倾去上清液，加入蒸馏水约1mL，并滴加少量0.5mol/LNa2CO3，使沉淀溶解，此时溶液pH6左右。搅拌条件下向溶液中滴加500g/LCaCl2(体积为聚丙烯酸量的1/12.5)，生成的沉淀挤压干后弃去。如所得溶液不够澄清，可以进行离心或简单过滤，并用少量水洗涤滤纸。收集滤液于刻度试管，记录体积，留样0.5mL(Ⅲ)待分析。
3.Sephadex G-50 柱层析
(1)装柱：称取15g Sephadex G-50，加入300mL 蒸馏水溶胀6小时以上，置热水浴中加热除去气泡，冷却后装入玻璃层析柱。用6g/LNaCl 溶液200mL 平衡层析柱。
(2)上样：向样液中加入固体NaCl 使终浓度为50g/L，上样时先吸去层析柱凝胶面上的溶液，再沿管壁滴加样品，样品量不宜超过10mL。加完后打开层析柱出口，让样品均匀流入凝胶内。
(3)洗脱：样品流完后，先分次加入少量6g/LNaCl 洗脱液洗下柱壁上的样品，然后接通蠕动泵，继续6g/LNaCl 洗脱，调节操作压力使流速控制在7~8mL/10min，部分收集器收集，10min 一管，共收集200mL 左右。
(4)分析：纪录各管体积，紫外光吸收法测定各管中蛋白质浓度。合并含有蛋白质的收集管，草酸鉴定Ca2+ ，留样(Ⅳ)待分析。
4.乙二醇浓缩：将洗脱液放入透析袋，外面裹以聚乙二醇，置于加盖容器中。当酶液水分被聚乙二醇吸收而浓缩至5mL 左右时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇，倒出浓缩液，记录体积，留样
0.5mL(Ⅴ)待分析。
(二)溶菌酶活力测定
取上述各待测酶液稀释30~50倍，进行酶活测定。用微量进样器取酶液样品10μL，加入0.5mL 的0.5mol/L 磷酸缓冲液(pH6.5)，混合均匀，37℃预热2min，然后加入同样已预热过的菌悬液0.5mL。37℃保温反应15min 后，用2mL 乳化剂停止反应。
反应液经3000r/min 离心10min，取清液在721型分光光度计上进行比色(540nm)。空白管用磷酸缓冲液替代样液。
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