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干细胞介绍支原体常用的几种检测方法
点击次数：557 发布时间：2017/8/30
支原体这种微小的微生物（直径0.2-0.8 µm），是细胞培养中令人头疼的大问题。支原体污染可能来自培养基、血清或实验操作者，会影响细胞生长率、细胞形态、基因表达、细胞代谢和细胞活力。支原体感染不易察觉，因此对培养细胞定期进行支原体检测就非常重要。
污染实验室培养细胞的支原体主要有八种，但还没有哪种检测方法能够单枪匹马把这八种支原体都检测出来。支原体非常顽强，通常用于细胞培养的绝大多数抗生素都对其无效。例如青霉素主要作用于细菌细胞壁，但支原体没有细胞壁因此就不受影响。无懈可击的细胞培养技术始终是预防支原体感染的*佳方式，另外及时找出受到支原体感染的培养物也很重要，这样才能在感染扩散前快速采取有效措施。本文就为你介绍了几种在培养细胞中检测支原体的常用方法。
分离培养法
分离培养法是支原体检测的金标方法，其检测精确度。这种方法是从可疑的细胞培养体系中取样，并接种到*适宜支原体生长的琼脂平板上。如果样本中含有支原体，它们就会在这种琼脂平板上疯狂生长，*终形成明显可见的特征性菌落。分离培养法基本不会出现假阴性结果，因此被誉为支原体检测金标准。不过分离培养法也存在两个弊端，一是检测时间太长，支原体要长出明显克隆至少需要4周时间。二是尽管可以检测绝大多数支原体种类，分离培养法也有力所不及的时候，例如支原体M. hyorhinis。
如果你实在不想等这么久，或者希望在分离培养法的等待过程中先拿到初步结果，你可以试一试DNA、PCR或酶学检测方法。不过需要注意的是，上述检测方法都不能单独检出所有类型的支原体，而且灵敏度也没有分离培养法高，所以结合使用两种方法以获得*可靠的检测结果。
DNA检测
DNA检测需要将可疑样品与指示细胞共同培养，因此一般需要几天时间。DNA检测所用的指示细胞通常是细胞质区域较大的Vero细胞，如果原样本中含有支原体，那么当细胞DNA被荧光染料（如Hoechst染料）染色时，就可以在指示细胞的核周围观察到荧光斑点或荧光颗粒。分离培养法用来检测支原体M. hyorhinis菌株并不可靠，而DNA法可以准确的将其检测出来。
PCR法
PCR法也可以检测M. hyorhinis菌株，PCR法检测支原体只需几个小时，是*快但也是*不灵敏的支原体检测方法。该方法采用针对支原体DNA的引物用PCR检测可疑样本，其中PCR引物通常针对支原体的16S rRNA基因。在凝胶电泳过程中，支原体DNA会显示为特异性条带，以此指示支原体的存在。PCR法可以检测大多数支原体，但谨慎起见同时使用另一种检测方法来进行验证。
4×SDS-PAGE浓缩胶缓冲液(pH=6.8)N/A500ml0
4×SDS-PAGE分离胶缓冲液(pH=8.8)N/A500ml0
10% SDS Solution10% SDS溶液N/A500ml
10%过硫酸铵溶液N/A5×1ml0
40%丙烯酰胺溶液(37.5：1)N/A500ml0
40%丙烯酰胺溶液(29：1)N/A500ml0
30%丙烯酰胺溶液(149：1)N/A500ml0
30%丙烯酰胺溶液(37.5：1)N/A500ml0
30%丙烯酰胺溶液(29：1)N/A500ml0
SDS-PAGE凝胶制备试剂盒N/A50块胶0
