继上回的准备篇和菌种篇，这回要真正测定了。在各个测定管孵育20小时以上获得浊度时，即可用涡旋振荡器混匀，之后倒入1cm比色杯，在540nm处测定吸光度（OD值）。以未接种的对照管的OD值为0，依次测定标准管、样本。如果对照管OD值＞0.1，或者标准管OD值变化＜40%，说明有杂菌或叶酸混入，需重做。

测完OD值后，以叶酸含量为横坐标，每个标准管OD均值为纵坐标，做标准曲线。根据样本OD值和标准曲线，可以确定样品对应的叶酸含量。关于标准曲线，有人发现OD值随着叶酸浓度增加而增长趋缓, 略呈S形。若使用线性方法，数据点分布在曲线两侧，求得的叶酸浓度不准。建议使用EXCEL功能建立4阶曲线方程，则曲线与实验数据的拟合程度较好（1）。

图1. 1阶线性拟合

图2. 4阶线性拟合，优于1阶

采用直接提取法进行的叶酸含量可按如下公式进行计算。其前提是：每个样品有2个管叶酸含量在0.10ng-0.80ng范围内，且各管间偏差小于10%。

计算公式：

叶酸含量（g/100g）= (C*V*f)/m * 0.1

C为样品稀释液叶酸浓度(ng/ml)，V为提取液定容体积（ml），f为样本提取液稀释倍数，m为样本质量（g），0.1为ng/g换算为g/100g的系数。

以上就是相对完整的测定过程，不仅适合婴儿配方食品，也适合谷薯、果蔬、豆及坚果类食品，只不过样品需要用酶解提取法。大致过程如下：准确称量适量试样（0.2-2g叶酸），如坚果类是0.2-2g，精确至0.0001g，转入100ml锥形瓶中，加30mlPBS（含抗坏血酸作为叶酸保护剂），混匀5分钟后高压灭菌。再加1ml鸡胰腺溶液。对于蛋白和淀粉含量丰富的样本，应再加1ml蛋白酶和淀粉酶溶液。再加3至5滴甲苯后，37℃孵育16小时，再转入100ml容量瓶，加水定容，过滤。

之所以采取酶解法，是因为在一些食品中叶酸以蛋白结合的形式存在，以上提取方法是依据中国预防科学院食品与卫生研究所对食品前提取方法进行的研究(2)。该研究还发现，蔬菜样品采用二次水解法效果；叶酸在酸性和过碱性环境中破坏严重，因此样品提取液和培养基pH值应控制在6.8-7.2。

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参考文献

1. 唐靓，等.国标〈食品中叶酸的测定〉的标准曲线绘制与计算.中国卫生检验杂志. 2009,19(7):

2.王竹. 样品前处理对食物中叶酸测定的影响.卫生研究. 2000, 29 (6):404-406

原创作者：北京缔一生物科技有限公司