介绍

肠杆菌科、大肠杆菌和大肠菌群是*常见的食品传染性细菌。对这些病原体的检测和量化是微生物食品和临床诊断实验室的一项重要任务。

包括生化鉴定在内的传统的细菌检测方法已经应用了很长时间。这些方法耗费时间和试验材料。以前的研究显示，大肠菌群，特别是大肠杆菌可作为食品和水污染的指示菌。它们的存在标示着饮用水和食品也受到了其他肠道病原菌的污染。因此在检测食品卫生方面，它们的分离和计数具有非常重要的作用。

ISO 6579-2003 描述了有关沙门氏菌在食品和饲料中的检测方法，它一共包括四个步骤，并且需要确证试验，需要持续5-7天，即：1.非选择性液体培养基中的前增菌；2.液体培养基中的选择性增菌；3.接种选择性培养基；4.对可疑菌落进行血清学和生化鉴定。

沙门氏菌属是导致胃肠炎的常见原因，对于它的检测，需要从粪便样本中分离病原菌。传统使用乳糖、pH指示剂，用于鉴别沙门氏菌（非乳糖发酵菌）。然而，经常有必要筛选许多其他的共生菌，如变形杆菌，它也不能发酵乳糖。筛选共生菌是一个耗时的过程，并且所需的血清学和生化鉴定试剂比较昂贵。

对天然污染食品样品的分析显示，用显色培养基对菌落计数和分离更加容易，特别是对蜡样芽孢杆菌。显色培养基中包含人工添加的显色底物，可被一些微生物特异的活性酶所裂解。

在过去30年中，一些病原菌靶向的高特异性显色培养基开发出来了。这些培养基采用了酶底物，经水解后释放出生色染料，导致病原菌形成带颜色的菌落，可轻易地与共生菌群相鉴别。理想状况时，共生菌群应被选择性因子完全抑制，或形成无色菌落，从而使靶向病原菌从背景菌群中“脱颖而出”。因此，它可区分含有这种酶的微生物和不含有这种酶的微生物。当样本含有多种菌群时，这一点对于检测特定的病原菌特别重要。而底物和水解产物对微生物生长不应有抑制效应。本次研究旨在评估两种显色培养基对于从食品中检测和分离肠杆菌科的效率。

材料与方法

培养基制备

脑心浸出液肉汤（BHI,Difco labortaries, USA），选择性培养基用于革兰氏阴性菌，麦康凯琼脂（Fluka BioChemika）,EMB琼脂（HiMedia Laboratories）和四硫磺酸钠煌绿肉汤(OXOID)用于大肠菌群和肠道致病菌，而亚硫酸铋琼脂（HiMedia）、HE琼脂（OXOID）、XLD琼脂（BD）和SS琼脂（Biolife）用于分离沙门氏菌属。

两种用于检测大肠杆菌和其他大肠菌群的显色培养基进行了制备，分别为HiCrome ECC琼脂(HIMEDIA)和沙门氏菌鉴别琼脂（Raj Hans Medium, HIMEDIA）。每种显色培养基制备时煮沸而不用高压灭菌。

食品样本

46个不同的食品样本（鸡蛋、色拉、奶制品、肉和加工过的大米）从伊拉克首都巴格达的当地市场上购买。

用不同培养基分离细菌

每种样本取25g加入到225ml生理盐水，每种0.1ml样本均液制备3个稀释度，分别在上述培养基中培养。平板在37度孵育24小时，使显色培养基中充分显色。

生化分析

指数生长期的分离菌落用API 50 CHL试剂盒（梅里埃）进行分析，遵循说明书进行。

结果和讨论

检查了46种不同食物样本。所有46个样品都包含肠杆菌科的混合菌群，其中大肠杆菌（n=28）、肺炎克雷伯氏菌（n=7），沙门氏菌属（n= 30）。在ECC和沙门氏菌鉴别琼脂菌上，每个分离的菌落都表现为特定颜色。食品样品的贮溶液含有多种类型的细菌，ECC琼脂上鉴别的颜色如图1所示。ECC上的大肠杆菌呈蓝紫色（图2）。

图1.

图2.

沙门氏菌在两种显色培养基上表现为：肠炎沙门氏菌在ECC上为无色菌落（图3A），伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌在沙门氏菌鉴别琼脂上是粉红色（图3B）。

图3A

图3B

肺炎克雷伯氏菌在沙门氏菌鉴别琼脂上为蓝色菌落（图4A），在ECC上为绿色（图4B）。

图4 A

图4 B

对分离的菌落初步鉴定是基于革兰染色。麦康凯琼脂能从形态上检测到肠杆菌科。从食品样本接种到增菌培养基如脑心浸液肉汤、麦康凯琼脂、EMB琼脂、BS琼脂、HE琼脂、TB肉汤、XLD琼脂、SS琼脂培养基上都出现肠杆菌科的大量生长，这使得难以分离疑似细菌。在比较用于肠杆菌科检测的显色培养基时，发现ECC和沙门氏菌鉴别琼脂*适合肠杆菌科成员，并适合用作食品中肠杆菌检测的指示培养基。用显色培养基（ECC沙门氏菌鉴别琼脂）替代麦康凯琼脂和EMB琼脂培养基，会使背景菌下降大约50%，然而并不减少待测菌的菌落数量。

有趣的是，来自食物样本的背景菌群受到强烈抑制。使用显色培养基分离的沙门氏菌菌落，通过多价沙门氏菌抗血清得到证实，其血清型为特定的O和H。分离株的*终确任是通过API 50试剂盒来确定肠杆菌科成员的糖发酵能力。它可用于肠杆菌科成员的鉴别。

近年来，生物技术的进步已经导致食品检测技术的改变。今天，我们受益匪浅于那些比传统方法更特异、更快速且通常具有更高灵敏度的方法。含有乳糖的培养基，加上pH指示剂，传统上用于从共生菌如大肠杆菌中鉴别出沙门氏菌。传统显色的原理是基于糖发酵，产生局部pH下降引发培养基中的指示剂颜色的变化。总的来说，我们实验的结果显示，两种类型的显色培养基有利于快速检测食物中的细菌，并具有高度选择性，不需要高压灭菌，而传统培养基则需高压灭菌，非常耗时，而且价格贵，选择性差。这些结果与其他人报告相一致（见注1）。

分离鉴定食品源性菌如肠杆菌科，在显色培养基上*为适合，这是因为由于这些菌的代谢活性与培养基中的底物反应，使菌落产生颜色而得以分离。在许多研究中，显色培养基已被证实显示出超过传统的培养基的优势，无论是目标病原菌的检测率上，还是混合菌群的区分上。显色培养基因为包含显色底物，肯定要比传统培养基更贵，但这可以通过减少对补充试剂的需求、减少与平板制备以及可疑菌落鉴定相关的劳动时间来抵消。由于这些因素，在诊断实验室中使用显色培养基日益广泛。很可能在未来几年内针对更广泛的病原体分离的显色培养基越来越多。Hicrome ECC琼脂和沙门氏菌鉴别琼脂在快速检测食品病原菌方面就是其中两款翘楚。

结论

从这项研究中可见，ECC和沙门氏菌鉴别琼脂显示中高特异性和灵敏度，这与其他报告一致。然而，该研究的局限是只采用了两款筛查肠杆菌的显色培养基。也可能有其他替代品用于更便宜地对肠杆菌科进行日常检查，以促进传染病防控措施的启动。

注1. Obeng-Nkrumah N, Twum–Danso K, Krogfelt KA, Newman MJ(2013). High levels of extended spectrum beta lactamase in a amajor teaching hospital in Ghana: The need for regular monitoring ａnd evaluation of antibiotic resistance. Am. J. Trop. Med. Hyg. 98:960-964.

注2.该论文中提到的HiMedia生产的两款显色培养基，具体为

HiCrome ECC Selective HiVeg Agar Base（货号MV1294）（需添加剂，货号FD190）

Salmonella Differential HiVeg Agar（货号MV1078）

原创作者：北京缔一生物科技有限公司