目前新guan病毒在疫苗研发和基础领域获得了更大的关注。许多新guan病毒的检测都针对的是ORF1ab和N基因或E基因，但本文介绍的是新guan病毒的另一个靶点RdRp基因（即RNA依赖性RNA聚合酶基因），用于病毒的检测，它不用于诊断，只用于研究。

一、新guan病毒RT-qPCR引物/探针（套装）（英文名：SARS-CoV-2 Confirm），用于定性检测和分析新guan病毒RNA。它包括3个成分：

①橙盖： 2019-nCoV Mix（冻干粉），1管。

此管为新guan病毒引物/探针，可特异性扩增新guan病毒的RdRp基因（即RNA依赖性RNA聚合酶基因），而其他冠状病毒RNA不会被检测到【1】【2】。（该引物/探针依据WHO诊断参考实验室公布的新guan病毒引物/探针序列而设计【1】。

如要检测其他冠状病毒，推荐MB公司提供的其他冠状病毒引物/探针，品名：CoV Screen (without ConviFlex™ RT-Taq Mix)，货号：271-1100。

②绿盖： Positive Control RNA（阳性对照RNA，冻干粉），1管。

此阳性对照RNA为一段合成的RNA序列（序列来自武汉的病毒株）。

③白盖： PCR Grade Water（液体），1管。

二、使用前，①橙盖和②绿盖先用PCR级水（③白盖）复溶，并分装，避免反复冻融。

该引物/探针应与MB公司提供的【RNA病毒检测试剂盒】（英文名：ConviFlex™RT-Taq Mix）一起使用，用于新guan病毒RT-qPCR反应检测。

三、检测样本需为抽提过的RNA样本。

四、新guan病毒的靶基因RdRp是用FAM™通道检测，扩增的人RNA酶P基因（过程对照）用ROX™通道检测，用以评估样本的制备质量。

五、该方法有三处特别的地方：

1. 靶点特别。依据WHO标准，此引物探针为新guan病毒RdRp基因，而非市面上常见的ORF1ab和N基因或E基因。

2.阳性对照RNA为一段合成的RNA序列（序列来自武汉的病毒株）。

3. 主要组分为冻干粉，4℃保存，储存运输方便，性能稳定。

4. 适用于科研中，各种来源的RNA样本，包括拭子、活检组织、哺乳动物细胞和细菌等。

六、操作注意事项：

该引物/探针应仅由经过培训的实验室人员使用。

始终穿上合适的防护fu和戴一次性手套。

根据样品类型，应谨慎处理所有样品。请遵循WHO推荐的方法处理样本。

该试剂盒不含有害物质。 残余物可以根据当地法规丢弃。

七、操作步骤：

步骤1. 试剂制备

①橙盖2019-nCoV Mix引物探针冻干粉，速离心5秒钟，加入525μl PCR级水（白盖），室温静置5分钟后，涡旋并离心5秒钟，分装，待用或-18℃保存。

②绿盖Positive Control RNA阳性对照冻干粉，速离心5秒钟，加入105μl PCR级水（白盖），室温静置5分钟后，涡旋并离心5秒钟，分装，待用或-18℃保存。

步骤2. RT-qPCR引物/探针mix制备（20μl 反应体积）

（1）1个反应需要加入：酶预混液 （自备的红盖预混液）10μl ，

橙盖（复溶的2019-nCoV Mix引物/探针）5μl 

（红盖预混液 来自MB公司的【RNA病毒检测试剂盒】（RT-qPCR法），

英文名：ConviFlexRT-Taq Mix, 货号192-0025/-0100/-0250，需单独购买）

（2）将以上引物/探针mix涡旋混匀，并离心5秒钟。

（3）每个PCR管中加入15μl上述引物/探针mix和5μl样本（抽提后的RNA），

或5μl RNA提取试剂盒中的洗脱缓冲液，作为阴性对照，或5μl PCR级水作为无模板对照，或5μl阳性对照RNA。

（4）紧扣PCR管，然后短暂离心。

（5）将PCR管放置qPCR仪上，紧上顶盖。

步骤3. 设置qPCR程序

1个循环： 55 ℃，10分钟

1个循环： 94 ℃，3 分钟

45个循环：94 ℃，15秒

58℃，30秒  

步骤4. 启动程序

步骤5. 数据解读

八、使用注意事项：

• 使用前应认真阅读说明书。
• 来自不同批次的试剂不能混合。
• 试剂盒内的试剂应始终作为一个整体溶解分装。
• 试剂盒应在效期内使用。
• 每次PCR至少应设置一个阳性对照。每次PCR至少应设置一个阴性对照和/或一个无模板对照。如果实验者自己抽提RNA，则可使用洗脱缓冲液作为阴性对照。对照必须与待测样品的处理方式相同。您也可能需要其他实验室提供的对照品，例如含高、中、低不同浓度的RNA样品。使用对照，对于确认结果的可靠性或用于排除故障非常有意义。
• 建议在无RNA和DNA污染的条件下进行RT-PCR，以避免操作过程中DNA或非特异RNA的交叉污染。（MB公司推荐使用PCR污染祛除喷雾，英文名：PCR Clean™，货号15-2025，预先清洁实验环境。）
• 尽量减少RNA样品的冻融次数，同时避免RNA酶污染，以减少RNA降解的风险。（RNA降解会极da地限制了RT-qPCR反应的性能）。请确保高质量的完整RNA用于检测。
• 样本制备过程中，注意避免其他DNA的污染，DNA的干扰也会降低qPCR的准确性。

九、参考文献

1. Corman VM, Bleicker T, Brünink S, Schneider J, Drosten C. Diagnostic detection of 2019-nCoV by real-time RT-PCR. 

2. Corman VM, Landt O, Kaiser M, Molenkamp R, Meijer A, Chu DKW, Bleicker T, Brünink S, Schneider J, Schmidt ML, Mulders DGJC, Haagmans BL, van der Veer B, van den Brink S, Wijsman L, Goderski G, Romette JL, Ellis J, Zambon M, Peiris M, Goossens H, Reusken C, Koopmans MPG, Drosten C. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020 25(3). doi: 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045.

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