和PCR比起来，qPCR不用跑胶，实时监测扩增状况，操作更为便捷。下面以德国MB Venor®GeM支原体检测试剂盒（qPCR一步法）（Venor®GeM qOneStep）为例，略述检测原理和过程。

   该试剂盒包括4管试剂，其中2管分别为缓冲液和PCR水，另2管为*主要试剂。1管即mix，含引物、核苷酸、聚合酶、荧光素标记的探针和内部扩增对照。另1管为阳性对照，均为冻干粉。

它通过扩增高度保守的rRNA操纵子，或者更准确地说，扩增支原体基因组中的16S rRNA编码区，可以特异性地检测支原体。在520nm（FAMTM通道）检测支原体特异性扩增片段。在610nm（HEXTM通道）检测内部扩增对照的扩增。它能特异性检测所有导致细胞污染的柔膜体物种。真核DNA不会被扩增。通过内部对照，可检测PCR抑制剂的存在或不正确的DNA提取引起的假阴性结果。样本为细胞培养上清液。检测程序可在3小时内完成。

在检测前，样本需要一定的制备。具体是将100μl细胞培养上清液转移至无菌的1.5 ml反应管中。关上盖子扣紧。将样品在95°C下孵育5分钟。以速度短暂离心样品（15秒）以沉淀任何细胞碎片。然后可直接取2μl上清液进行qPCR。

qPCR反应体系一共是25ul，其中样本2ul，其余是master mix。注意设置阳性对照、阴性对照（无模板对照）。

如果检测的Ct<40，则表明PCR结果阳性。如果检测的Ct≥40，则PCR反应结果为阴性。如果FAM阳性，则支原体阳性。如果FAM阴性，HEX也阴性，表明PCR扩增出了问题，需要重做。如果FAM阴性，HEX阳性，表明支原体确实阴性。

PCR扩增出了问题主要原因为PCR反应被抑制了，可能需要考虑做DNA抽提。

在qPCR反应中，引物和探针的设计尤为重要，它既需要覆盖大多数支原体，又需要不与细菌和哺乳动物细胞DNA发生交叉反应。当然，Taq酶的性能也很重要，因为DNA的扩增*终依赖于酶的活性和扩增的速度。从这个角度说，一个好的qPCR试剂盒是各个因素共同作用的结果。

原创作者：北京缔一生物科技有限公司