为什么新guan病毒不能只检测一个靶点

目前，市面上常见的新guan病毒检测靶点为ORF1ab和N基因或E基因。

但据WHO的相关文件，随着疫情的进行，新guan病毒的靶点序列可能会产生突变，从而导致引物/探针无法与目的序列结合，导致假阴性。因此WHO建议检测多个靶点。

以往上建议筛查时先检测E基因（包膜基因），在确证时检测RdRp基因（即RNA依赖性RNA聚合酶基因），该基因有助于辨别新guan与其他冠状病毒【1】【2】。

参考文献：

1. Corman VM, Bleicker T, Brünink S, Schneider J, Drosten C. Diagnostic detection of 2019-nCoV by real-time RT-PCR. 

  2. Corman VM, Landt O, Kaiser M, Molenkamp R, Meijer A, Chu DKW, Bleicker T, Brünink S, Schneider J, Schmidt ML, Mulders DGJC, Haagmans BL, van der Veer B, van den Brink S, Wijsman L, Goderski G, Romette JL, Ellis J, Zambon M, Peiris M, Goossens H, Reusken C, Koopmans MPG, Drosten C. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020 25(3). doi: 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045.

下面笔者即来介绍这款新guan病毒引物/探针。

一、用途：

新guan病毒RT-qPCR引物/探针（套装）（英文名：SARS-CoV-2 Confirm），用于定性检测和分析新guan病毒RNA。它仅用于研究，不用于临床诊断。

二、描述：

  1. 该产品包括三个小管：

     ①橙盖： 2019-nCoV Mix（冻干粉），1管。此管即新guan病毒引物/探针，可特异性扩增新guan病毒的RdRp基因（即RNA依赖性RNA聚合酶基因），而其他冠状病毒RNA不会被检测到。（该引物/探针依据WHO诊断参考实验室公布的新guan病毒引物/探针序列而设计）。

     ②绿盖：Positive Control RNA（阳性对照RNA，冻干粉），1管。

    此阳性对照RNA为一段合成的RNA序列（序列来自武汉的病毒株）。

     ③白盖：PCR Grade Water（液体），1管。

  2.使用前，①橙盖和②绿盖先用PCR级水（③白盖）复溶，并分装，避免反复冻融。

  3.该引物/探针应与MB公司提供的【RNA病毒检测试剂盒】（英文名：ConviFlex™RT-Taq Mix,货号192-0025/-0100/-0250）一起使用，用于新guan病毒RT-qPCR反应检测。

  4．检测样本需为抽提过的RNA样本。

  5.新guan病毒的靶基因RdRp是用FAM™通道检测，扩增的人RNA酶P基因（过程对照）用ROX™通道检测，用以评估样本的制备质量。

三、产品特点：

  1. 靶点特别。依据WHO标准，此引物探针为新guan病毒RdRp基因，而非市面上常见的ORF1ab和N基因或E基因。

  2.阳性对照RNA为一段合成的RNA序列（序列来自武汉的病毒株）。

  3. 主要组分为冻干粉，4℃保存，储存运输方便，性能稳定。

  4. 适用于科研中，各种来源的RNA样本，包括拭子、活检组织、哺乳动物细胞和细菌等。

四：使用：

RT-qPCR引物/探针mix制备（20μl反应体积）

（1）1个反应需要加入：

酶预混液 （RT-qPCR mix）10μl ，

橙盖（复溶的2019-nCoVMix引物/探针）5μl

（2）将以上引物/探针mix涡旋混匀，并离心5秒钟。

设置qPCR程序

1个循环：55 ℃，10分钟

1个循环：94 ℃，3 分钟

45个循环：94 ℃，15秒

               58℃，30秒

*终用FAM和ROX检测。

更多参考文献，请见：

1. Corman, V.M., et al., Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill, 2020. 25(3).

2. LeBlanc, J.J., et al., Real-time PCR-based SARS-CoV-2 detection in Canadian Laboratories. J Clin Virol, 2020: p. 104433.

3. Uhteg, K., et al., Comparing the analytical performance of three SARS-CoV-2 molecular diagnostic assays. J Clin Virol, 2020. 127: p. 104384.

4. van Kasteren, P.B., et al., Comparison of seven commercial RT-PCR diagnostic kits for. J Clin Virol, 2020. 128: p. 104412.

5. Lowe, C.F., et al., Detection of low levels of SARS-CoV-2 RNA from nasopharyngeal swabs using three commercial molecular assays. J Clin Virol, 2020. 128: p. 104387.

6. Igloi, Z., et al., Comparison of commercial realtime reverse transcription PCR assays for the detection of SARS-CoV-2. J Clin Virol, 2020. 129: p. 104510.

原创作者：北京缔一生物科技有限公司