培养细胞时，要避免细菌污染。如果存在细菌污染，则培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显，细胞大多在24小时死亡。在以细胞大规模培养为基础的生物药产业中，也需要进行无菌检查。传统无菌检查是采用TSA或TSB培养基培养的方法，一般需要培养14天，观察是否有菌落生长或溶液浑浊。

现介绍一种通过PCR进行无菌检查的方法，当然该方法也是用于研究。即采用德国MB的细菌检测试剂盒（Onar Bacteria Detection Kit）。它作为PCR试剂盒，针对的是细菌高度保守的16S rRNA序列，阳性产物片段大小为467 bp，可跑胶后在紫外灯下观察。另包含一个内控对照，用于检测PCR反应是否正常，该内控对照条带为140 bp。

需要注意的是，样品在检测前，应在95 °C做热灭活 5分钟，之后每个PCR反应是加5ul。另外，细胞培养液中应不含抗生素，细胞应在不含抗生素的培养基中培养一代，因为抗生素会使细菌水平保持在检测限以下（2.4×10的3次方/ml）。另外，检测时应做复孔。整个反应体系为25ul。

该试剂盒可检测的细菌包括：假单胞菌，放线菌，大肠埃希氏菌，沙雷氏菌，卟啉单胞菌，梭菌，葡萄球菌，链球菌，乳杆菌，微球菌，芽孢杆菌，克雷伯菌，沙门氏菌，肠球菌，分枝杆菌，军团菌，葡萄球菌，消化链球菌。它不检测真菌、病毒和真核细胞DNA。

典型结果如下：

总之，早期筛查细胞培养时是否有细菌污染，可以及时采取措施，而PCR方法更为灵敏、快速和稳定，可以根据实际情况酌情使用。

 图. 内控对照显示PCR反应正常，样本中无PCR抑制成分。460bp左右存在目的条带，提示存在细菌污染。

原创作者：北京缔一生物科技有限公司