生物制品和细胞治疗企业已越来越多地采用核酸法进行支原体的检查和生产质控。核酸法如替代药典方法，则需进行方法验证。

现在一些地方在使用德国MB公司的支原体标准品或支原体基因组DNA（定量标准品），包括灵敏度标准品（10CFU,100CFU）、特异性标准品以及PCR定量标准品，其中灵敏度标准品也可用于耐用性的验证。

MB厂家具有ISO 9001和ISO 13485质量体系认证。每个批次支原体标准品都有验证和质控。同时支原体培养所用的培养基每个批次都符合欧洲药品质量管理局（EDQM）的标准。标准品每个批次都提供有质控证书（COA）。标准品所用的支原体菌株来自英国NCTC菌种保藏中心，同时具有相应的ATCC编号。

下面对MB厂家的三类标准品的质控方面做一介绍。

（一）支原体灵敏度标准品

10CFU™支原体灵敏度标准品为灭活支原体，这样不会对实验室造成支原体污染。它用于核酸法的灵敏度和耐用性验证。它每盒含3管10CFU支原体冻干粉，2管阴性对照。灵敏度标准品主要经过下列三方面的质控：

1. 功能检测：

即标准品复溶后作DNA抽提（采用MB公司的Venor®GeM Sample Preparation Kit），再用符合药典标准的qPCR试剂盒检测，应保证有扩增曲线。

2. 活力检测：

即标准品在培养基中复溶并培养7天后，再进行DNA抽提和qPCR检测，Ct值和对照组比，应不超过允许阈值（ΔCt >2）。该检测主要是确保支原体均已灭活。

3.*di阈限检测和批次合格标准：

标准品用DMEM+5%FCS进行10倍梯度稀释，形成3个稀释度，DNA抽提后然后进行前后3轮qPCR检测，每轮每个稀释度重复8次。每种支原体的Ct平均值应达到一定标准，方为合格。

（二）支原体基因组DNA——特异性验证用

该基因组DNA是从相应的支原体中抽提出来，并制成冻干粉。每管为10ng左右。复溶时，每管加100ml厂家提供的Tris缓冲液，室温静置5分钟，再涡旋离心5秒钟。

厂家对基因组中的16S rRNA段进行了序列分析，要求应与相应支原体物种的同源性应达到99%以上。对制备的DNA质量和数量进行了荧光分析和PCR扩增。PCR扩增应显示为单一的扩增条带。

（三）PCR定量标准品

每管为1x108拷贝的支原体物种基因组DNA冻干粉，使用时也是先用厂家提供的Tris缓冲液复溶。质控时，对16S rRNA的部分序列进行测序分析，以鉴定支原体物种，测序结果应显示为99%以上的同源性。再对该标准品作系列梯度稀释，再进行qPCR扩增，应显示为良好的线性。该方法还可确定qPCR方法的检测阈值。

MB公司的上述三类标准品可用于对支原体核酸法的方法学验证，包括灵敏度、特异性和耐用性。其中，基因组DNA除了包括常见支原体物种外，还包括一些常见细菌，用于验证常规PCR或qPCR的检测是否会产生交叉反应。

总之，良好的质控是标准品品质的保证，这样才能确保方法验证结果的可靠性，使支原体的核酸法检测符合药典所规定的标准，从而为替代培养法等经典支原体的检测方法提供数据支持。

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原创作者：北京缔一生物科技有限公司